PRACTICA XXVIII (19/01/15)

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA EN SANGRE

INTRODUCCIÓN

Es el paso fundamental en el diagnóstico de las anemias
Es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La hemoglobina es una proteína que contiene hierro. Otorga el color rojo a la sangre, es una heteroproteína (ferroproteína) compuesta por dos porciones, la primera no proteica (hemo) y la segunda proteica (globina). La globina la compone la hemoglobina A por dos cadenas alfa y dos beta, la hemoglobina A2 por dos cadenas alfa y dos delta y por último la fetal que la componen dos cadenas alfa y dos gamma
Se encuentra en los glóbulos rojos y se encarga de transportar oxígeno por la sangre desde los pulmones hasta los tejidos
Por debajo valores normales: anemias, cáncer, embarazo...
Por alto valores normales: cardiopatías, deshidratación, estancias a gran altitud
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio
La muestra será de sangre capilar o venosa (anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato)
La estabilidad de la muestra es 1 semana a 2-8ºC

https://www.google.es/search?q=hemoglobina&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=fLLsVMb2BYj7UOT

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MATERIAL

• Tubos de ensayo
• Pipetas
• Espectofotómetro
• Cubetas (1,0 cm de paso de luz)

 

https://www.google.es/search?q=determinacion+de+hemoglobina&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=rL

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REACTIVOS

• Hemoglobin 50x (Ferricianuro de potasio 0,60mmol/L, Cianuro de potasio 77mmol/L y dihidrogeno fosfato de potasio 2mmol/L) ; El cianuro es venenoso, su concentración es sensiblemente menor que la dosis mínima letal para el adulto, su adificación puede provocar liberación de ácido cianhídrico y el cianuro de potasio es nocivo (Xn), en contacto con ácidos libera gases muy tóxicos
• Hemoglobin Cal (Patrón de Hemoglobina 15g/dL, de origen animal)

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Para la preparación del reactivo de trabajo: para 5ml (4,9 ml de agua destilada + 2 gotas de reactivo) para 250 ml (245ml agua destilada + 1 frasco (5ml) de reactivo)
• Mezclar bien
• Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso
• No usar reactivos fuera de la fecha indicada
• Indicadores de deterioro de los reactivos: presencia de partículas y turbidez, absorbancia del blanco a 540nm >-0,01
• 1.- Condiciones del ensayo:
• Longitud de onda: 540nm
• Cubeta: 1cm paso de luz
• Temperatura: 15-25ºC
• 2.-Ajustar el espectrofotómetro a cero frente agua destilada
• 3.-Pipetear:
• A) Método macro
•                                               Blanco                            Patrón                          Muestra
• RT (ml)                                     5,0                                 5,0                                  5,0
• Calibrador (microlitros)                                                20
• Muestra (microlitros)                                                                                            20
• Pero nosotros hemos utilizado el método micro
• B) Método micro
•                                              Blanco                            Patrón                          Muestra
• RT (ml)                                     2,5                                 2,5                                  2,5
• Calibrador (microlitros)                                                10
• Muestra (microlitros)                                                                                            10
• 4.- Mezclar e incubar 3minutos a temperatura ambiente (15-25ºC)
• 5.- Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo
• Se habla de valores de referencia, existen diferencias entre zonas geográficas y grupos étnicos
• La base es la reacción hay que medir todo con reactivo, primero siempre el blanco para que desquite espectofotómetro
• Uso espectofómetro:
• 1 Encender (enter)
• 2 fecha (enter)
• 3 nº1 absorbancia
• 4 nº1 monocromática
• 5 nº5 (540nm enter)
• 6 nº100 vol muestra (enter)
• 7 nº0 tiempo (enter)
• 8 nº0 temperatura (enter)
• 9 blanco (pump)
• 10 patrón (pump)
• 11 muestra (pump)
• 12 agua destilada en cubeta (wash)

OBSERVACIÓN

Valores:
Hombres: 14-18 g/dL
Mujeres: 12-16 g/dL
Niños: 10-14 g/dL

Lo hemos calculado mediante:

• Con factor: (A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra
• Con patrón:
•          (A)Muestra / (A) Patrón x 15(Concent Patrón) = g/dL de hemoglobina en la muestra

Nuestros calculos han sido

0,238/0,136 x 15
0,143/0,136 x 15
0,069/0,136 x 7,5

Después hemos realizado el cálculo mediante la gráfica, donde cogemos 4 tubos de ensayo donde el Blanco pondríamos con pipeta 2,5 RT, patrón nº1 (7,5 concentración + 2,5 RT), patrón nº2 (3,75 concentración + 2,5 RT) éste si no está hecho cogemos 2 tubos de ensayo pequeños y echamos 10 microlitros en el primer tubo de 7,5 concentración y en el segundo tubo cogeríamos 5 microlitros de 7,5 concentración + 10 microlitros de agua destilada) y por último la muestra (2,5 RT + 10 microlitros de sangre)
Leemos nuestra absorbancia y realizamos nuestra gráfica correspodiente