martes, 24 de febrero de 2015

PRACTICA XXVIII (19/01/15)


DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA EN SANGRE

INTRODUCCIÓN

Es el paso fundamental en el diagnóstico de las anemias
Es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La hemoglobina es una proteína que contiene hierro. Otorga el color rojo a la sangre, es una heteroproteína (ferroproteína) compuesta por dos porciones, la primera no proteica (hemo) y la segunda proteica (globina). La globina la compone la hemoglobina A por dos cadenas alfa y dos beta, la hemoglobina A2 por dos cadenas alfa y dos delta y por último la fetal que la componen dos cadenas alfa y dos gamma
Se encuentra en los glóbulos rojos y se encarga de transportar oxígeno por la sangre desde los pulmones hasta los tejidos
Por debajo valores normales: anemias, cáncer, embarazo...
Por alto valores normales: cardiopatías, deshidratación, estancias a gran altitud
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio
La muestra será de sangre capilar o venosa (anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato)
La estabilidad de la muestra es 1 semana a 2-8ºC
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MATERIAL
  • Tubos de ensayo
  • Pipetas
  • Espectofotómetro
  • Cubetas (1,0 cm de paso de luz)
 
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REACTIVOS
  • Hemoglobin 50x (Ferricianuro de potasio 0,60mmol/L, Cianuro de potasio 77mmol/L y dihidrogeno fosfato de potasio 2mmol/L) ; El cianuro es venenoso, su concentración es sensiblemente menor que la dosis mínima letal para el adulto, su adificación puede provocar liberación de ácido cianhídrico y el cianuro de potasio es nocivo (Xn), en contacto con ácidos libera gases muy tóxicos
  • Hemoglobin Cal (Patrón de Hemoglobina 15g/dL, de origen animal)
TÉCNICA O PROCEDIMIENTO
  • Para la preparación del reactivo de trabajo: para 5ml (4,9 ml de agua destilada + 2 gotas de reactivo) para 250 ml (245ml agua destilada + 1 frasco (5ml) de reactivo)
  • Mezclar bien
  • Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso
  • No usar reactivos fuera de la fecha indicada
  • Indicadores de deterioro de los reactivos: presencia de partículas y turbidez, absorbancia del blanco a 540nm >-0,01
  • 1.- Condiciones del ensayo:
  • Longitud de onda: 540nm
  • Cubeta: 1cm paso de luz
  • Temperatura: 15-25ºC
  • 2.-Ajustar el espectrofotómetro a cero frente agua destilada
  • 3.-Pipetear:
  • A) Método macro
  •                                               Blanco                            Patrón                          Muestra
  • RT (ml)                                     5,0                                 5,0                                  5,0
  • Calibrador (microlitros)                                                20
  • Muestra (microlitros)                                                                                            20
  • Pero nosotros hemos utilizado el método micro
  • B) Método micro
  •                                              Blanco                            Patrón                          Muestra
  • RT (ml)                                     2,5                                 2,5                                  2,5
  • Calibrador (microlitros)                                                10
  • Muestra (microlitros)                                                                                            10
  • 4.- Mezclar e incubar 3minutos a temperatura ambiente (15-25ºC)
  • 5.- Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo
  • Se habla de valores de referencia, existen diferencias entre zonas geográficas y grupos étnicos
  • La base es la reacción hay que medir todo con reactivo, primero siempre el blanco para que desquite espectofotómetro
  • Uso espectofómetro:
  • 1 Encender (enter)
  • 2 fecha (enter)
  • 3 nº1 absorbancia
  • 4 nº1 monocromática
  • 5 nº5 (540nm enter)
  • 6 nº100 vol muestra (enter)
  • 7 nº0 tiempo (enter)
  • 8 nº0 temperatura (enter)
  • 9 blanco (pump)
  • 10 patrón (pump)
  • 11 muestra (pump)
  • 12 agua destilada en cubeta (wash)
OBSERVACIÓN

Valores:
Hombres: 14-18 g/dL
Mujeres: 12-16 g/dL
Niños: 10-14 g/dL

Lo hemos calculado mediante:
  • Con factor: (A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra
  • Con patrón:
  •          (A)Muestra / (A) Patrón x 15(Concent Patrón) = g/dL de hemoglobina en la muestra
Nuestros calculos han sido

0,238/0,136 x 15
0,143/0,136 x 15
0,069/0,136 x 7,5

Después hemos realizado el cálculo mediante la gráfica, donde cogemos 4 tubos de ensayo donde el Blanco pondríamos con pipeta 2,5 RT, patrón nº1 (7,5 concentración + 2,5 RT), patrón nº2 (3,75 concentración + 2,5 RT) éste si no está hecho cogemos 2 tubos de ensayo pequeños y echamos 10 microlitros en el primer tubo de 7,5 concentración y en el segundo tubo cogeríamos 5 microlitros de 7,5 concentración + 10 microlitros de agua destilada) y por último la muestra (2,5 RT + 10 microlitros de sangre)
Leemos nuestra absorbancia y realizamos nuestra gráfica correspodiente





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