ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA
MATERIAL
- Tiras de cellogel 2,5x17cm. Cod 01ª11-25 (ATUM 27185). Si se gasta el líquido de la bolsa se rellena con metanol
- Aplicador de electroforesis semimicro
- Rodillo
- Bandeja
- Fuente de alimentación/cubeta/puente
- Placa de vidrio
- Suero fisiológico
- Agua destilada
- Solución decolorante: Solución Ácido acético 5%
- Solución transparentadora de electroforesis (metanol, ciclohexanona, ac acético glacial)
- Una vez mezclamos la solución A y B caduca a los 15 días
- Cloroformo
- Metanol
- Tampon o buffer Tris-hippurate. Cod 02c11-12. Ph 8,8 cellogel
- Colorante: Negro amido o rojo
Imagen reallizada en el laboratorio
- Anticoagular la sangre problema
- Poner 3ml de sangre problema en 2 tubos de centrifuga de cristal conicos graduados
- Centrifugar 3000rpm/5min. Retirar el sobrenadante
- Poner 4-5ml de suero fisiológico, homogeneizar y volver a centrifugar 3000rpm/5min
- Lavar 3 veces mas (en total 4 lavados)
- En el último lavado nos quedamos con el sedimento (aprox 1ml)
- Al sedimento (volumen) le añadimos 1/2 volumen de cloroformo y 1,5 volumenes de agua destilada. Ejemplo: 1ml de sangre sedimentada + 0,5 ml de cloroformo + 1,5 ml de agua destilada.
- Agitar la mezcla en el agitador de tubos vibratorio
- Centrifugar 3000rpm/20min
- Coger el sobrenadante que será nuestra muestra con la que trabajaremos
- Colocar la fuente de alimentación, la cubeta y los electrodos correctamente
- Colocación de cables: rojo (anodo)+ y negro (catodo -)
- Poner solucion tampon en la cubeta
- Sacamos la tira de cellogel con las pinzas con cuidado de no verter el líquido de conservación de las tiras.
- Colocar la tira en el tampon para que empape bien 10min
- Sacar las tiras de cellogel y secarlas con papel de filtro
- Montar el puente: Poner la cara absorbente hacia arriba (poner la esquina cortada en la derecha y mirando hacia el operador). Los 2 extremos de la tira deben tocar la solución tampón
- Para meter la tira en el puente: meter los 2 extremos de la tira por las ranuras del puente
- Para colocar la muestra, tener en cuenta que el hemolizado tendra que ir del catodo al anodo
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- Para ello, poner unas gotas de bemolizado (sobrenadante) sobre un porta y con el aplicador mojamos para coger muestra y dejamos la muestra sobre la tira de celogel aprox a 1,5 cm del extremo catodico y marcamos conn rotulador permanente ese sitio
- Tapamos la cubeta y ponemos en marcha el alimentador (400 voltios/10 min)
- Poner negro amido en la bandeja
- Una vez ha terminado la electroforesis, desconectamos y sacamos la tira del puente con pinzas
- Colocamos la tira boca abajo en el negro amido 10min agitando la bandeja
- Retirar el negro amido de la bandeja, y cubrir la tira con solución de ácido acético 5%
- (Solucion decolocantre) Hacer 3 lavados de 10 minutos con ácido acético
- Quitar el ácido acético y sumergir las tiras en metanol 1 minuto
- Tirar el metanol
- Poner la solución transparentadora 2-3min
- Retirar la solución transparentadora y sacar la tira de la bandeja y colocar encima de una placa de vidrio con la cara absorbente hacia abajo y aplastar con el rodillo
- Meter a la estufa (60-70ºC) hasta que la tira quede transparente del todo (5-6minutos)
- Esta práctica no la he realizado como todas las anteriores ya que se sigue un protocolo hemos observado el día que la realizamos que no hay que poner mucha sangre con una punta de micropipeta
- Las tiras cuando sale del tampón secarlas bien con papel de filtro
- La centrifugación fue realizada a 3500 rpm/10min siendo la última 5minutos
- También nos sirve el rojo punzón, hemos usado el negro amido porque había más
- Cuanto más se separe más tipos de Hb podemos ver
- La siguiente imagen fue realizada en el laboratorio así apreciamos nuestros tipos de Hb:
Imagen realizada en el laboratorio
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