ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS HEMATÍES
INTRODUCCIÓN
El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil
Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de Hb que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis)
Condiciones normales: un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen un 70% como máximo
Esta prueba evalúa la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de su contenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE, que puede variar de unos a otros en la misma sangre)
La muestra es sangre venosa completa y anticoagulada (anticoagulante: heparina)
No deben haber pasado más de 2h desde la extracción de la sangre hasta su utilización, en el caso de que la muestra se haya conservado a 4ºC puede prolongarse este tiempo a 6h
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- Pipetas Pasteur
- Tubos de centrífuga
- Reloj
- Centrífuga
- Espectofotómetro
- Cubetas de espectofotómetro
- Gradilla
- Suero fisiológico, preparándose:
2,7 de fosfato sódico di-básico
0,2 de fosfato sódico mono-básico
1000ml de agua destilada
- Agua destilada
TÉCNICA O PROCEDIMIENTO
- Prepara batería de soluciones de cloruro sódico: (hemos utilizado 8 tubos preparando los 4 primeros y los 4 últimos)
Tubo 2: 1 " " " 17 " " " 8,5 " "
Tubo 3: 2 " " " 16 " " " 8 " "
Tubo 4: 3 " " " 15 " " " 7,5 " "
Tubo 5: 4 " " " 14 " " " 7 " "
Tubo 6: 5 " " " 13 " " " 6,5 " "
Tubo 7: 6 " " " 12 " " " 6 " "
Tubo 8: 7 " " " 11 " " " 5,5 " "
Tubo 9: 8 " " " 10 " " " 5 " "
Tubo 10:9 " " " 9 " " " 4,5 " "
Tubo 11: 10 " " 8 " " " 4 " "
Tubo 12: 11 " " 7 " " " 3,5 " "
Tubo 13: 12 " " 6 " " " 3 " "
Tubo 14: 13 " " 5 " " " 2,5 " "
Tubo 15: 14 " " 4 " " " 2 " "
Tubo 16: 15 " " 3 " " " 1,5 " "
Tubo 17: 16 " " 2 " " " 1 " "
Tubo 18: 17 " " 1 " " " 0,5 " "
- Añadir a cada tubo 50 microlitros de sangre completa ( debe hacerse de forma que la gota llegue a la solución de cloruro sódico sin que toque la pared interna del tubo)
- Agitar los tubos
- Dejar los tubos en reposo 30 minutos a temperatura ambiente
- Centrifugar los tubos a 2000 rpm/5min o dejarlos en reposo durante 3 horas
- Aquí observamos la presencia o ausencia de hemólisis en los tubos, utilizaremos el espectofotómetro
- Lectura visual: se considera que no hay hemólisis cuando en el tubo se observa un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. Hay hemólisis parcial cuando se advierte la presencia de un botón sedimentario, que se acompaña de un sobrenadante rojizo y transparente. Y, es hemólisis total cuando sólo se aprecia la existencia de un líquido rojizo y transparente
- Si los eritrocitos presentes en el botón sedimentario de cualquier tubo se resuspenden mediante agitación, el sobrenadante se enturbiará
- Espectofotómetro: el procedimiento ya está explicado en anteriores prácticas, por tanto en la presente se recoge de forma separada el líquido contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia ajustando la longitud de onda (540nm)
- Blanco: líquido presente en tubo nº1
- Resultados en forma de %, tubo nº18 corresponderá a un 100%, el más hipotónico, el más hemolizado
- Fórmula:
%de hemólisis=A/Am x 100
(A: absorbancia líquido en el tubo analizado, Am: absorbancia líquido en tubo nº18)
- Hemólisis parcial clara en tubo nº10 (50% de hemólisis)
- Hemólisis total a nivel del 12,13,14
- ROE baja: esferocitosis hereditaria, eliptocitosis u ovalocitosis congénita y estomatocitosis hereditaria, en estas enfermedades la superficie de los hematíes está disminuida con respecto a su volumen, éstos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmótica
- ROE sube: la aparición de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solución salina a una concentración menor que lo prvisto. En talasemia minor y anemia ferropénica, estas células tienen incrementada su superficie en relación con su volumen, toleran mejor la entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osmóstica
HOJA DE TRABAJO
A) ¿Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico?
7,4
B) ¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que éstos se rompan?
70%
C) ¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba?
Heparina
D) En esta prueba, ¿cuál es la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones?
0,5g/l
E) ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE?
Talasemia minor y anemia ferropénica
RESULTADOS OBTENIDOS
Tubo nº1 : 0,149
Tubo nº2: 0,958
Tubo nº3: 1,081
Tubo nº4: 1,206
Tubo nº15: 1,208
Tubo nº16: 1,197Tubo nº17: 1,203
Tubo nº18: 1,99
Ejemplo tubo nº1: 0,149/1,99 x 100; 7,48%
(Nota: en la práctica hemos cogido los 4 primeros tubos y los 4 últimos. En el espectofotómetro hay que ponerlos del más diluido al más concentrado, se van poniendo el más claro es decir el 1, los hematíes no se habrán roto. Cuando se habla de concentración se habla de color)
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