PRACTICA LII (21/05/15)

 

PRUEBA CRUZADA MAYOR

INTRODUCCIÓN

El objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar las posibles reacciones antígeno-anticuerpo entre la sangre del donante y del receptor, antes de la transfusión
Hay que hacer una serie de determinaciones:
Tipaje correcto del grupo ABO y Rh del donante y del receptor
Escrutinio de los anticuerpos irregulares en el receptor
Prueba cruzada mayor
Otras pruebas son: prueba cruzada menor (sólo se realiza cuando se transfunde gran cantidad de plasma) y autocontrol
Estas pruebas deben realizarse en medio salino y albuminoso
El fundamento de esta práctica es enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante primero en medio salino y luego albuminoso y por último frente al suero antiglobulina de Coombs. Detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados en la membrana
Es importante respetar los tiempos de incubación
Muestra: suero del receptor obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis. Debe ser fresco y conservado a 4ºC
Y, hematíes del donante, previamente lavados y resuspendidos al 2-5%

 

https://www.google.es/search?q=numeros+romanos&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0CAY

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MATERIAL

• Tubos de hemólisis
• Centrífuga
• Baño de agua
• Pipeta Pasteur
• Gradilla
• Reloj

REACTIVOS

• Solución salina fisiológica
• Albúmina bovina al 30%
• Suero antiglobulina de Coombs

Imagen realizada en el Laboratorio

 

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Depositar una gota de suspensión de hematíes del donante y 2 gotas del suero del receptor
• Mezclar
• Dejar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos
• Centrifugar 3500 rpm durante 30 segundos
• Leer el resultado en medio salino
• Añadir 3 gotas de albúmina bovina al 30%
• Mezclar
• Incubar a 37ºC durante 30 minutos
• Centrifugar 3500 rpm durante 30 segundos
• Leer los resultados en medio albuminoso
• Lavar 3 veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos
• Retirar sobrenadante del último lavado
• Añadir una gota de suero antiglobulina humana de Coombs
• Mezclaar
• Centrifugar a 1000 rpm durante 2 minutos
• Leer resultados

 

OBSERVACIÓN

• La lectura se realiza resuspendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones
• Ausencia de aglutinación: sangres son compatibles y la transfusión es compatible

https://www.google.es/search?q=numeros+romanos&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0CAYQ_A

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• La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad, igual que si observamos hemólisis
• Es conveniente realizar esta prueba en medio enzimático, dado que refuerza las reacciones antígeno-anticuerpo, se usa para re-examinar a los receptores que han sufrido reacciones transfusionales

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HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?

Suero del receptor con hematíes del donante

 

B) ¿Cuando se debe realizar la prueba cruzada menor?

Cuando se transfunde una gran cantidad de plasma

 

C) ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoideo?

Para detectar todos los anticuerpos presentes

 

D) ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs?

Detectar anticuerpos que hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria

 

Valoración de los resultados

 

Las sangres analizadas son: Compatibles

PRACTICA LI (21/05/15)

 

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA

INTRODUCCIÓN

La concentración de Hb debe seer determinada cada vez que haya una donación
Valores mínimos:
12,5 g/dl mujeres
13,5 g/dl hombres
Las donaciones sólo se hacen por debajo de estos niveles
Esta determinación rápida se basa en el hecho de que una sangre con una concentración de Hb superior a la permitida tiene que tener una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre. Por lo que, una gota de sangre cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre
Para donantes varones se debe preparar la solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1,054 g/cm3 (1,055 g/dl dado en clase) ya que la gota de sangre con Hb cae a una concentración superior a 13 g/dl
Para mujeres donantes es a 1,052 g/cm3 (1,053 g/dl dado en clase) ya que la gota cae a una concentración superior a 12 g/dl
Muestra: sangre capilar previamente recogida del pulpejo del quinto dedo

MATERIAL

• Material de extracción de sangre capilar
• Vaso de precipitado de 50 ml

REACTIVOS

• Solución de sulfato de cobre:
• (disolver 17 g de sulfato en 100 ml de agua destilada, añadir 0,74 ml de agua destilada. Mezclar 51 ml de solución madre con 49 ml de agua destilada)

Imagenes realizadas en el Laboratorio


TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Verter 50 ml de solución en un vaso de precipitado
• Recoger gota de sangre problema

Imagen realizada en el Laboratorio

• Dejar caer la gota sobre la solución

OBSERVACIÓN

• Si la gota es más densa que la solución, cae a través de ella y si es menos densa no caerá al fondo del vaso de precipitado
• Gota con más de 12 g/dl de Hb tiene una densidad mayor que 1,052 g/cm3, es decir que el sujeto puede donar sangre
• En el caso contrario, la donación no puede ser efectuada
• Si la gota flota será anemia

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación?
12,5 g/dl

B) ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de sangre?
Solución de sulfato de cobre

Valoración de los resultados

El donante es apto: sí

 

Imagen realizada en el Laboratorio

PRACTICA L (20/05/15)

DETERMINACIÓN DE UN Du

INTRODUCCIÓN

Los anticuerpos tipo IgG son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes por sí solos, son capaces de adherirse a sus superficie tanto in vivo como in vitro y decimos que han sensibilizado a los hematíes, capaces de fijar el complemento , sin llegar a producir hemólisis de los eritrocitos
Estos anticuerpos tipo IgG pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen anticuerpos antiglobulina humana del tipo IgM
Resultado: aglutinación de los hematíes
Este suero es lo que llamamos: suero de Coombs, puede ser de dos tipos:
Poliespecífico: si está dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento
Monoespecífico: contra la IgG o contra algún componente

La prueba de Coombs puede realizarse de dos modos:
Prueba directa: detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo, para ello lo enfrentamos al suero de Coombs y observamos si existe o no aglutinación
Prueba indirecta: donde el paso previo es la sensibilización de los eritrocitos in vitro para hacerlos reaccionar con el suero de Coombs, en este caso buscamos anticuerpos incompletos libres en l suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes
El Du es un antígeno D débil, por ello debemos sensibilizar los hematíes problema con un suero que contiee anticuerpos anti-D para enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno Du en la superficie de los eritrocitos se producirá la unión de anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana, y en la segunda fase darán aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana
Esta es una prueba de Coombs indirecta
Muestra: hematíes suspendidos al 5%

MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Centrífuga
• Pipetas Pasteur
• Gradilla
• Baño de agua
• Reloj

REACTIVOS

• Suero anti-D humano
• Suero antiglobulina humana de conejo (suero de Coombs)
• Solución salina fisiológica

Imagen realizada en el Laboratorio

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• En un tubo echar una gota de suero anti-D y una gota de suspensión de hematíes al 5%

Imagen realizada en el Laboratorio

• Mezclar
• Incubar a 37ºC durante 30-45 minutos

Imagen realizada en el Laboratorio

• Lavar los hematíes en solución salina fisiológica tres veces
• Decantar completamente la solución salina después del último lavado
• Añadir sobre el sedimento una gota de suero de Coombs
• Mezclar suavemente
• Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto

OBSERVACIÓN

• Golpeamos para observar la aglutinación
• Si existe, el Rh es positivo (en la membrana tienen el antígeno Du y se clasifica como Rh positivo variante de Du), y si no existe se clasifica como Rh negativo
• Para evitar falsos positivos debido a una sensibilización previa de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema, esto nos servirá como control negativo

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué contiene el suero de Coombs?
Anticuerpos anti-D

B) ¿Qué se detecta con la prueba directa?
Falsos positivos

C) ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?
Anticuerpos incompletos libres en suero o presencia de antígenos débiles en membrana de hematíes

D) ¿Qué buscamos en la sangre del paciente?
Antígeno Du

E) ¿Qué ocurre si el control es positivo?
Hay antígeno Du

Valoración de los resultados

La sangre es: Rh positivo

PRACTICA XLIX (13/05/15)

DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS HUMANOS EN SECUENCIAS VNTR

 PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

OBJETIVOS

• Adquisición de destrezas en la utilización de técnicas de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis de agarosa
• Adquisición de destrezas en la utilización técnicas de amplificación de ácidos nucleicos mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

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• Aprender a interpretar los resultados de una electroforesis en gel de agarosa de ácidos nucleicos
• Iniciarse en la interpretación de los resultados d una "huella molecualr de DNA" a través del análisis de secuencias VNTR

REACTIVOS

• Solución salina 0,9%
• Resina InstaGene Matrix de Bioser
• Oligonucleótidos
• PureTaq Ready To Go PCR
• Tampón TBE o TAE
• Gel de agarosa en polvo
• Marcador de Peso Molecular
• Intercalante para ADN

PROCEDIMIENTO

• Enjuagar la boca con 10 ml de solución salina

 

https://www.google.es/search?q=pcr&biw=1280&bih=705&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0CDcQsARqFQo

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70%3B503

• Depositar el enjuague en un vaso
• Pipetear 1,4 ml y transferir a un tubo eppendorf
• Centrifugar durante 5 minutos a 8000 rpm
• Decantar el sobrenadante
• Transferir 70 microlitros de InstaGene 6% al tubo eppendorf
• Resuspender las células con micropipeta
• Incubar la muestra en baño hirviendo durante 10 minutos
• Sacar el tubo y enfriar dos minutos a temperatura ambiente
• Centrifugar 30 segundos a 13000 rpm
• Transferir 10 microlitros de sobrenadante a un tubo eppendorf
• Guardar la muestra conteniendo el DNA cromosómico en hielo

 

https://www.google.es/search?q=pcr&biw=1280&bih=705&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0CDcQsARqFQoTCPu

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Para realizar la PCR utilizamos las bolitas Ready-To-Go PCR:

• Añadir: 18,5 microlitros de agua bidestilada estéril, 2 microlitros de oligo 1, 2 microlitros de oligo 2
• Golpear
• Añadir 2,5 microlitros de la muestra de ADN y mezclar
• Mantener los tubos en hielo
• (Desnaturalización previa, desnaturalización, alineamiento, polimerización, polimerización final y mantenimiento en frío)
• Cargar en gel de agarosa y realizar electroforesis:
• Pesar 0,45 g de agarosa
• Añadir 30 ml de tampón IX TBE
• Fundir la agarosa en baño a 100ºC
• Enfriar en baño a 50ºC
• Añadir bromuro de etidio
• Verter en una bandeja de electroforesis
• Dejar solidificar 30 minutos
• Quitar el peine con cuidado y cubrir con tampón 1XTBE (Los pocillos deben de estar cerca del cátodo)
• Colocar los cables
• Pasar a un tubo eppendorf 9 microlitros del DNA procedente de la PCR y añadir tampón

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• Añadir a otro eppendorf: 4,5 miicrolitros del ladder + 0,5 microlitros de tampón de carga
• Cargar los 10 microlitros de cada muestra de DNA en los pocillos
• Cargar otro pocillo los 5 microlitros (Ladder)
• Aplicar la corriente (70-120 voltios) durante 30 minutos a 120 voltios
• Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen

(Nota: La práctica fue realizada el 13 de mayo día en el que estábamos en los cursos, por tanto he copiado el protocolo dado en clase sobre la práctica)

PRACTICA XLVIII (7/05/15)

 

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh

INTRODUCCIÓN

El genotipo de una persona es su dotación genética en el cromosoma, y el fenotipo es la manifestación de ese genotipo. El fenotipo es la sua total de antígenos detectados en los hematíes mediante el empleo de antisueros específicos
El fenotipo puede ser idéntico al genotipo
Dado que no existe el antígeno d, ni el anticuerpo anti-d, es imposible determinar si el antígeno D es homozigoto o heterozigoto mediante su detección en los hematíes. Determinamos el genotipo más probable
El interés en la determinación del genotipo se debe a que existen casos de madres inmunizadas frente a D, y conviene conocer si el padre es o no homozigoto para D, antes de producrise un nuevo embarazo. Un padre homozaigoto D transmitirá el gen D a todos sus hijos, mientras que uno heterozigoto lo transmitirá con un 50% de probabilidades
El fenotipo se determina enfrentando los hematíes problma con los antisueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e
El genotipo más probable dependerá de la raza o el grupo étnico
El genotipo del sistema Rh se enfrentan a los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh, la existencia o no de estos antígeno en la superficie de los hematíes se detecta por una reacción de aglutinación. Los resultados se trasladan a una tabla donde vemos los posibles genotipos
Muestra: Suspensión de hematíes lavados al 5%

 

 

http://biologia.uab.es/base/myimages/cursogenetica/genotipo-fenotipo.jpg

 

MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Centrífuga
• Rotulador
• Pipetas Pasteur
• Gradilla

REACTIVOS

• Suero anti-D
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c
• Solución salina fisiológica

Imagen realizada en el Laboratorio

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Cogemos nuestra muestra al 5%
• Rotulamos nuestros 5 tubos, cada uno con su letra correspondiente
• En cada tubo añadimos una gota del antisuero y una gota de la suspensión de hematíes

• Homogeneizamos suavemente
• Centrifugar a un minuto durante 1000 rpm

OBSERVACIÓN

• Golpeamos suavemente para despegar el sedimento hemático
• El resultado positivo es la presencia de aglutinación y se observa la presencia de grumos rojos sobre un líquido claro. Indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo
• La ausencia de aglutinación es un resultado negativo, y se obsera como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo
• Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada
• Si la sangre analizada es Rh negativa (D-) se determina su único genotipo posible con respecto al sistema Rh. Si la sangre es Rh positiva (D+) existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado

 

http://gsdl.bvs.sld.cu/greenstone/collect/preclini/index/assoc/HASH092e.dir/tab6.12.png

 

 

HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿Qué antisueros se utilizan en esta técnica?

Anti-D, anti-E, anti-C, anti-e y anti-c

 

B) ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

Fenotipo de la sangre

 

C) Si la sangre es Rh+, ¿puede determinarse su genotipo con respecto al sistema Rh?

Existen varios genotipos que dan lugar al fenotipo detectado

 

D) Si los resultados obtenidos son: D-, C-, E+, c+ y e- ; ¿cuál es el genotipo posible de esta sangre?

Rh-

dcE/dcE

 

 

Valoración de los resultados

 

El/los genotipo/s posible/s del sistema Rh en la sangre analizada es/son: No nos ha salido bien ya que los hematíes estaban mal lavados

La hemos realizado una segunda vez, dando los siguiente resultados:

D= +

C= -

E= +

e= +

c=+

Es Rh positivo y su genotipo posible es: DcE/dce      DcE/Dce        Dce/dcE



PRACTICA XLVII (5/05/15)

 

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO

INTRODUCCIÓN

Empleamos sueros anti-D que pueden ser de tipo salino o albuminoideo. Los hematíes pueden revestirse in vivo de anticuerpos o proteínas plasmáticas anormales, y en presencia de albúmina producir agregación que daría la idea de una aglutinación positiva. Empleamos albúmina en el tubo de manera que si aparece aglutinación en este debemos repetir la prueba pero usando suero anti-D en medio salino
Ponemos de manifiesto la presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D
Muestra: hematíes suspendidos al 5%

MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Rotulador
• Gradilla
• Pipeta Pasteur
• Centrífuga

REACTIVOS

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina fisiológica (al 0,9%)

Imagen realizada en el Laboratorio


TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Rotular dos tubos uno con la letra D y otro A
• En el tubo D añadir una gota de suero anti-D y el tubo A una gota de albúmina bovina al 30%
• A cada tubo le añadimos una gota de suspensión al 5%

Imagen realizada en el Laboratorio

• Agitamos
• Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto

OBSERVACION

• Golpeamos el fondo de los tubos
• Aglutinación positiva cuando aparecen grumos rojos sobre un líquido claro
• Aglutinación negativa cuando se resuspenden homogéneamente
• Albúmina: Control negativo, por tanto: asusencia de aglutinación
• Tubo D aglutina y A no: Rh positivo
• Si no hay aglutinación en ninguno de los tubos incubamos a 37ºC durante media hora, centrifugamos 1000 rpm durante 1 minuto y observamos, si aún así persiste la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un Du (D débil) mediante una prueba de Coombs indirecta, si aún así es la no aglutinación informaremos que el paciente es: Rh negativo

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D?
Incubar a 37ºC y centrifrugar 1000 rpm, observar

B) ¿Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?
No Du

C) ¿Cómo se prepara la muestra problema?
Lavando hematíes y añadiendo suero anti-D y albúmina bovina al 30%

Valoración de los resultados

La sangre analizada es: Rh positivo

PRACTICA XLVI (5/05/15)

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA

INTRODUCCIÓN

Se puede determinar tanto en porta como en tubo. En porta, hay que mencionar que la aglutinación se favorece por el calor
La técnica está basada en la detección del antígeno D, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D
En el caso que los hematíes contengan el antígeno D se producirá aglutinación
Muestra: sangre total anticoagulada

MATERIAL

• Portaobjetos
• Pipeta Pasteur
• Rotulador
• Palillos
• Visualizador luminoso

REACTIVOS

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30%

Imagen realizada en el Laboratorio


TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Dividimos el porta en 2 secciones una con la letra S y otra con la letra A
• Colocamos 2 gotas de suero anti-D en la sección S y en la sección A dos gotas de albúmina bovina al 30%
• Depositamos una gota de sangre en cada sección
• Colocamos el porta sobre el visualizador calentándolo y balanceamos para favorecer la mezcla

Imagen realizada en el Laboratorio

OBSERVACIÓN

• Esperar 2 minutos
• Aglutinación positiva: aparición de grumos rojos sobre un fondo claro, no confundir con restos de fibrina
• Aglutinación negativa: la mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes
• La mezcla de sangre con albúmina bovina debe dar siempre aglutinación negativa, en caso de no ser así no podemos informar sobre el resultado de la prueba

Sección S                  Sección A           Interpretación
     +                                 -                       Rh positivo
      -                                 -                       Rh negativo
      +                               +                           ¿?


HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?
Sangre total anticoagulada

B) ¿Para qué se utiliza el visualizador?
Calentar el porta y observar mejor los resultados

C) ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones?
Pequeños coágulos de fibrina

D) ¿Qué ocurre si aglutina la sección A?
Rh positivo

Valoración de los resultados

La sangre analizada es: Rh positivo

Imagen realizada en el Laboratorio

Gráfica de la clase de 1º de Laboratorio de Diagnóstico Clínico

(Nota: Las dos gráficas tanto determinación celular en porta como determinación del grupo Rh en porta, están realizadas por mí, en el programa Excel y a continuación paint y añadidas a mis prácticas como una imagen)