PRACTICA XLIX (13/05/15)

DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS HUMANOS EN SECUENCIAS VNTR

 PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

OBJETIVOS

• Adquisición de destrezas en la utilización de técnicas de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis de agarosa
• Adquisición de destrezas en la utilización técnicas de amplificación de ácidos nucleicos mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

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• Aprender a interpretar los resultados de una electroforesis en gel de agarosa de ácidos nucleicos
• Iniciarse en la interpretación de los resultados d una "huella molecualr de DNA" a través del análisis de secuencias VNTR

REACTIVOS

• Solución salina 0,9%
• Resina InstaGene Matrix de Bioser
• Oligonucleótidos
• PureTaq Ready To Go PCR
• Tampón TBE o TAE
• Gel de agarosa en polvo
• Marcador de Peso Molecular
• Intercalante para ADN

PROCEDIMIENTO

• Enjuagar la boca con 10 ml de solución salina

 

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• Depositar el enjuague en un vaso
• Pipetear 1,4 ml y transferir a un tubo eppendorf
• Centrifugar durante 5 minutos a 8000 rpm
• Decantar el sobrenadante
• Transferir 70 microlitros de InstaGene 6% al tubo eppendorf
• Resuspender las células con micropipeta
• Incubar la muestra en baño hirviendo durante 10 minutos
• Sacar el tubo y enfriar dos minutos a temperatura ambiente
• Centrifugar 30 segundos a 13000 rpm
• Transferir 10 microlitros de sobrenadante a un tubo eppendorf
• Guardar la muestra conteniendo el DNA cromosómico en hielo

 

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Para realizar la PCR utilizamos las bolitas Ready-To-Go PCR:

• Añadir: 18,5 microlitros de agua bidestilada estéril, 2 microlitros de oligo 1, 2 microlitros de oligo 2
• Golpear
• Añadir 2,5 microlitros de la muestra de ADN y mezclar
• Mantener los tubos en hielo
• (Desnaturalización previa, desnaturalización, alineamiento, polimerización, polimerización final y mantenimiento en frío)
• Cargar en gel de agarosa y realizar electroforesis:
• Pesar 0,45 g de agarosa
• Añadir 30 ml de tampón IX TBE
• Fundir la agarosa en baño a 100ºC
• Enfriar en baño a 50ºC
• Añadir bromuro de etidio
• Verter en una bandeja de electroforesis
• Dejar solidificar 30 minutos
• Quitar el peine con cuidado y cubrir con tampón 1XTBE (Los pocillos deben de estar cerca del cátodo)
• Colocar los cables
• Pasar a un tubo eppendorf 9 microlitros del DNA procedente de la PCR y añadir tampón

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• Añadir a otro eppendorf: 4,5 miicrolitros del ladder + 0,5 microlitros de tampón de carga
• Cargar los 10 microlitros de cada muestra de DNA en los pocillos
• Cargar otro pocillo los 5 microlitros (Ladder)
• Aplicar la corriente (70-120 voltios) durante 30 minutos a 120 voltios
• Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen

(Nota: La práctica fue realizada el 13 de mayo día en el que estábamos en los cursos, por tanto he copiado el protocolo dado en clase sobre la práctica)