PRACTICA XLVII (5/05/15)

 

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO

INTRODUCCIÓN

Empleamos sueros anti-D que pueden ser de tipo salino o albuminoideo. Los hematíes pueden revestirse in vivo de anticuerpos o proteínas plasmáticas anormales, y en presencia de albúmina producir agregación que daría la idea de una aglutinación positiva. Empleamos albúmina en el tubo de manera que si aparece aglutinación en este debemos repetir la prueba pero usando suero anti-D en medio salino
Ponemos de manifiesto la presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D
Muestra: hematíes suspendidos al 5%

MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Rotulador
• Gradilla
• Pipeta Pasteur
• Centrífuga

REACTIVOS

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina fisiológica (al 0,9%)

Imagen realizada en el Laboratorio


TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Rotular dos tubos uno con la letra D y otro A
• En el tubo D añadir una gota de suero anti-D y el tubo A una gota de albúmina bovina al 30%
• A cada tubo le añadimos una gota de suspensión al 5%

Imagen realizada en el Laboratorio

• Agitamos
• Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto

OBSERVACION

• Golpeamos el fondo de los tubos
• Aglutinación positiva cuando aparecen grumos rojos sobre un líquido claro
• Aglutinación negativa cuando se resuspenden homogéneamente
• Albúmina: Control negativo, por tanto: asusencia de aglutinación
• Tubo D aglutina y A no: Rh positivo
• Si no hay aglutinación en ninguno de los tubos incubamos a 37ºC durante media hora, centrifugamos 1000 rpm durante 1 minuto y observamos, si aún así persiste la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un Du (D débil) mediante una prueba de Coombs indirecta, si aún así es la no aglutinación informaremos que el paciente es: Rh negativo

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D?
Incubar a 37ºC y centrifrugar 1000 rpm, observar

B) ¿Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?
No Du

C) ¿Cómo se prepara la muestra problema?
Lavando hematíes y añadiendo suero anti-D y albúmina bovina al 30%

Valoración de los resultados

La sangre analizada es: Rh positivo

PRACTICA XLVI (5/05/15)

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA

INTRODUCCIÓN

Se puede determinar tanto en porta como en tubo. En porta, hay que mencionar que la aglutinación se favorece por el calor
La técnica está basada en la detección del antígeno D, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D
En el caso que los hematíes contengan el antígeno D se producirá aglutinación
Muestra: sangre total anticoagulada

MATERIAL

• Portaobjetos
• Pipeta Pasteur
• Rotulador
• Palillos
• Visualizador luminoso

REACTIVOS

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30%

Imagen realizada en el Laboratorio


TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Dividimos el porta en 2 secciones una con la letra S y otra con la letra A
• Colocamos 2 gotas de suero anti-D en la sección S y en la sección A dos gotas de albúmina bovina al 30%
• Depositamos una gota de sangre en cada sección
• Colocamos el porta sobre el visualizador calentándolo y balanceamos para favorecer la mezcla

Imagen realizada en el Laboratorio

OBSERVACIÓN

• Esperar 2 minutos
• Aglutinación positiva: aparición de grumos rojos sobre un fondo claro, no confundir con restos de fibrina
• Aglutinación negativa: la mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes
• La mezcla de sangre con albúmina bovina debe dar siempre aglutinación negativa, en caso de no ser así no podemos informar sobre el resultado de la prueba

Sección S                  Sección A           Interpretación
     +                                 -                       Rh positivo
      -                                 -                       Rh negativo
      +                               +                           ¿?


HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?
Sangre total anticoagulada

B) ¿Para qué se utiliza el visualizador?
Calentar el porta y observar mejor los resultados

C) ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones?
Pequeños coágulos de fibrina

D) ¿Qué ocurre si aglutina la sección A?
Rh positivo

Valoración de los resultados

La sangre analizada es: Rh positivo

Imagen realizada en el Laboratorio

Gráfica de la clase de 1º de Laboratorio de Diagnóstico Clínico

(Nota: Las dos gráficas tanto determinación celular en porta como determinación del grupo Rh en porta, están realizadas por mí, en el programa Excel y a continuación paint y añadidas a mis prácticas como una imagen)

PRACTICA XLV (27/04/15)

 

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO ABO

INTRODUCCIÓN

El suero de un individuo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentados a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes
Esta técnica puede realizarse tanto en porta como en tubo, aunque se prefiere en tubo
En el caso de que no se disponga de suero para realizar esta prueba, se recomienda que otro técnico compruebe el resultado de la determinación celular
Muestra: suero obtenido mediante coagulación de la sangre en baño de agua a 37ºC durante 20 o 30 minutos, posteriormente centrifugamos durante 10 minutos a 3000 rpm y extraemos el sobrenadante

MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Centrífuga
• Gradilla
• Pipeta Pasteur
• Baño de agua
• Reloj
• Rotulador

REACTIVOS

• Hematíes del grupo A1
• Hematíes del grupo A2
• Hematíes del grupo B
• Hematíes del grupo 0
• Hematíes de la sangre problema

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Para evitar falsos negativos por la presencia de complemento activo en el suero, comenzamos inactivando la muestra, se realiza manteniendo el suero en un baño de agua a 56ºC durante 10 minutos, así evitamos los fenómenos de hemólisis debidos al complemento

Imagen realizada en el Laboratorio

• Suspensión de hematíes al 5%, el día de la práctica en clase los teníamos al 2% y no se obtuvieron resultados ya que estaban demasiados lavados y tendrían que estar al 5%, la cual también la realizamos
• Rotulamos un tubo con la letra A1, otro con la letra A2, otro B, otro 0, y otro C
• Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado
• Depositamos una gota de la suspensiónn de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotuladoo. En el tubo C añadimos una gota de la suspensión de los hematíes propios de la sangre problema,ya que nos servirá de control negativo
• Agitamos y centrifugamos 1000 rpm durante 1 minuto

OBSERVACIÓN

• Golpeamos para desprender el sedimento
• Si aparecen grumos rojos flotando en un líquido claro indica aglutinación en el caso contrario se resuspenden homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo

Tubo A1 Tubo A2 Tubo B Tubo 0  Tubo C  Ac presentes en el suero Grupo eritrocitario
     -               -                +            -              -                Anti-B                                    A1
   - o +           -                +           -               -             Anti-B y anti-A1                       A2
     +              +               -            -               -                Anti-A                                     B
     +             +               +            -               -             Anti-A y anti-B                          0
     -              -                -            -               -                 Ninguno                               A1B
   -o +           -                -            -               -               Ninguno o Anti-A1                A2B
     +             +               +           +              +             Autoanticuerpos                   Ininterpretable

• Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacidos ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados, también encontramos dificultados en los pacientes con agammaglobulinemia ya que carecen de anticuerpos y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecíficos capaces di reaccionar con los antígenos del grupo ABO

Discrepancias entre la prueba celular y la sérica

• (En el caso de no obtener el mismo resultado)
• Repetir ambas pruebas
• Si persiste la discrepancia se obtiene una nueva muestra de sangre y se realizan hematíes lavados y resuspendidos
• Efectuar una prueba de Coombs directo sobre los hematíes para detectar posibles autoanticuerpos
• Realizar la prueba sérica utilizando un panel de screening con hematíes A1, A2, B, 0

Causas de las discrepacias

Errores técnicos:

• Indentificación incorrecta de las muestras
• No añadir suficiente reactivo y muestra
• Contaminación de los reactivos o hematíes del panel de screeaning
• Proporción inadecuada de muestra y reactivos
• Sobrecentrifugación o centrifugación insuficiente
• No valorar la hemólisis considerándola como aglutinación negativa

Problemas con la muestra:

• Presencia de autoanticuerpos
• Antígenos A o B débiles, congénitos o adquiridos
• Especificidad B adquirida en pacientes A1 por una infección bacteriana
• Inmunodeficiencias congénitas o adquiridas
• Fenómenos de Rouleaux

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué son los hematíes tipados?
Lavados, se utiliza para pruebas con suero

B) ¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente?
Solución salina isotónica

C) ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?
Suero

D) ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?
Cuando son enfrentados a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes

Imágenes realizadas en el Laboratorio

Valoración de los resultados

Suero 1
A1  NO
A2  SI
B    NO
0     NO
Grupo eritrocitario: A1

Suero 2
A1 NO
A2 SI
B   NO
0    NO
Grupo eritrocitario: B

Suero 3
A1 NO
A2 SI
B  NO
0   NO
Grupo eritrocitario: A2

Suero 4
A1 NO
A2 NO
B   NO
0    NO
Grupo eritrocitario: A2

PRACTICA XLIV (24/04/15)

 

LAVADO DE HEMATÍES Y SUSPENSIÓN DE HEMATÍES TIPADOS

INTRODUCCIÓN

Realizamos un lavado de hematíes para suspenderlos al 2% y al 5%
Muestra: sangre de distintos grupos sanguíneos


MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Centrífuga
• Gradillas
• Rotulador
• Pipeta Pasteur

Imagen realizada en el Laboratorio


REACTIVOS

• Solución salina fisiológica

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Tomar 1 ml de sangre ABO conocido y completar con solución salina
• Centrifugar 2000 rpm durante 4 minutos
• Retirar el sobrenadante

Imagen realizada en el Laboratorio

• Repetir 2 veces mas
• Preparar hematíes al 2% y 5%

5% =     ml soluto  
           ___________    x 100
           5ml solución



ml soluto =     5 x 5
                     _______   = 0,25 ml
                         100

0,25 ml lo pasamos a 250 microlitros hematíes y se lo restamos a 5 ml nos da 4,75 ml de solución salina


Por otra parte, realizamos la regla de 3

2ml ------- 100 ml
 X ---------- 5 ml

X=  0,1 ml = 100 ml si suponemos que una gota es 50 ml, echaremos 2 gotas y si lo restamos nos quedaria 4,9 ml de solución salina


OBSERVACIÓN

• A continuación dejo unas fotos echas de los hematíes y procedimiento de los mismos tras ser lavados para cada mesa y diferentes grupos

Imágenes realizadas en el Laboratorio

PRACTICA XLIII (23/04/15)

 

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO

INTRODUCCIÓN

Los hematíes problema contienen sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos
Resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes
Muestra: sangre total anticoagulada, aunque es preferible usar una suspensión de los hematíes problema

MATERIAL

• Tubos de centrífuga
• Rotulador
• Pipetas Pasteur
• Centrífuga
• Gradillas

REACTIVOS

• Suero anti-A
• Suero anti-B
• Suero anti-AB
• Solución salina fisiológica

 

Imagen realizada en el Laboratorio

 

 

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Coger la muestra de los hematíes lavados al 2%
• Rotular los 3 tubos de ensayo con las letras A, B y AB
• Añadir a cada tubo una gota de suspensión de hematíes al 2%
• Añadir dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B en el tubo B y dos gotas de anti-AB en el tubo AB
• Centrifugar 1000 rpm durante 1 minuto

 

Imagen realizada en el Laboratorio


OBSERVACIÓN

• Golpeamos para desprender el sedimento y observamos la presencia o ausencia de aglutinación
• Reacción negativa: los hematíes se resuspenden homogéneamente
• Reacción positiva: se observa un botón de hematíes que permanece unidos una vez desprendido el sedimento
• Se realiza igual que la técnica en porta
• Los restos de detergente o sustancias extrañas pueden ocasionar falsos negativos
• Falsos positivos:
• Aglutinación no específica: presencia de ácido hialurónico en la sangre
• Fenómeno de Rouleaux: imagen de pilas de moneda, las sustancias que pueden originar este fenómeno son el fibrinógeno, el dextrano
• Estos fenómenos se evitan con: lavado previo de los hematíes problema

Imagen realizada en el Laboratorio

 

 

HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis?

Aglutinación

 

B) ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problema?

Al 2%

 

C) ¿Cómo se ve una aglutinación positiva?

Se ve enn precipitado, en grumos

 

D) ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?

Al no realizar el lavado previo de hematíes

 

E) ¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos?

Realizando un lavado previo de hematíes

 

Valoración de los resultados

 

La sangre ensayada es del grupo eritrocitario: 0

PRACTICA XLII (22/04/15)

DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA

INTRODUCCIÓN

La detección celular del grupo ABO puede realizarse mediante una técnica en porta o en tubo. Los hematíes problema, contienen sustancias antigénicas del sistema ABO, se enfrentan con antisueros (aglutininas) dirigidos contra esos antígenos
Resultado final: aglutinación directa cuando reaccionan contra el antisuero
Para estudios in vitro se utilizan anticuerpos anti-A, anti-B y anti-AB. Sin embargo, como aglutininas anti-A1 o anti-H se utilizan lectinas (proteínas presentes en algunas plantas capaces de aglutinar a los hematíes humanos)
Es importante mencionar que todas estas determinaciones deben hacerse a temperatura ambiente, ya que la aplicación del calor puede afectar a los hematíes impidiendo observar una posible aglutinación
En resumen, consiste en observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo ABO del individuo
Muestra: sangre capilar o sangre total anticoagulada



 

 

http://neetcurioso.com/wp-content/uploads/2013/08/gota-de-sangre.jpg

 

 

MATERIAL

• Portaobjetos
• Rotulador
• Pipeta Pasteur
• Palillos
• Reloj

REACTIVOS

• Suero anti-A

Imagen realizada en el Laboratorio

• Suero anti-B

Imagen realizada en el Laboratorio

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Dividimos el portaobjetos en 2 secciones una marcamos con la letra A y otra la letra B
• Depositar una gota de suero anti-A y suero anti-B en cada parte correspondiente
• Situamos una gota de sangre junto a la gota de cada antisuero
• Mezclamos las gotas con un palillo y formando un círculo de 2 a 2,5 cm de diámetro
• Hacemos oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrás durante dos minutos
• Observamos la presencia o ausencia de aglutinación

Imagen realizada en el Laboratorio: donde ha aglutinado en la sección B por tanto, es grupo B

 

 

OBSERVACIÓN

 

• Aglutinación: grumos rojos que flotan en un líquido claro, en el caso contrario los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo
• Estas pruebas son muy eficaces ya que la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacción y el tamaño de los grumos
• El resultado puede observarse en unos segundos, aunque conviene reexaminar la reacción del anti-A al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil

 

Hematíes y suero anti-A       Hematíes y suero anti-B     Grupo eritrocitario

 

               +                                              -                                          A

               -                                              +                                          B

              +                                             +                                         AB

               -                                              -                                           0

 

HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿Qué tipo de técnica inmunológic se emplea en este análisis?

Aglutinación

 

B) ¿Qué muestra utilizamos?

Sangre capilar o sangre anticoagulada

 

C) ¿Cómo se ve la aglutinación positiva?

Grumos rojos que flotan en un líquido claro

 

D) ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A?

Los hematíes problema deberán de ser ensayados de nuevo con lectina anti-a1, si produce aglutinación, el sujeto pertenerá al subgrupo A1

 

Valoración de los resultados

 

La sangre analizada es del grupo eritrocitario:

 

 

Imagen realizada en el Laboratorio, donde tenemos a una persona del grupo A, otra del grupo B y otra del grupo 0
 

Gráfica de la clase de 1º de Laboratorio de Diagnóstico Clínico

 



PRACTICA XXXVII (4/03/15)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA)

 

INTRODUCCIÓN

Tiempo que tarda en coagular un PPP, tras su recalcificación y en presencia de un sustituto de f3p
La recalcificación se realiza mediante la adición de una solución de cloruro cálcico (CaCl2), el sustituto consiste en una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejos (cefalina)
Factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias: caolín, polvo de vidrio, sílice, celite y ácido elágico
Muestra: plasma pobre en plaquetas (PPP)


MATERIAL

• Gradilla
• 2 cubetas de coagulómetro
• 2 trocitos de acero
• Pipeta automática (100 microlitros)
• Puntas de pipeta amarillas
• Coagulómetro

• Baño de agua 37ºC
• 4 tubos de ensayo de plástico

REACTIVOS

• Solución cloruro cálcico 0,025 M
• Cefalina activada con ácido elágico
• Pool de plasmas normales o un plasma control normal

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Homogeneizar reactivos y muestra, sin agitarlos bruscamente
• Depositar volumen necesario
• Atemperar: 37ºC durante 5 a 15 minutos
• Introducir trocito de acero en cada una de las cubetas
• Tubo con letra M (muestra) y otro con letra C (control)
• Verter  100 microlitros de muestra : cubeta M
• Verter 100 microlitros de plasma control normal : cubeta C
• Añadir 100 microlitros de cefalina activada
• Mezclarlo bien
• Incubar a 37ºC durante 2 minutos, placa calefactora
• Colocarla y agregar 100 microlitros de CaCl2 0,025 M
• Al agregarlo se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comieza su lectura
• Cuando se forma el coágulo finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de CaCl2

OBSERVACIÓN

• TTPA: adición CaCl2 hasta la formación coágulo de fibrina
• Lo más correcto es determinar 2 veces y hacer su media correspondiente
• Nomrla: 30 y 40 segundos, tiempo superior se considera alargado, y también es anormal un TTPA de la muestra superior, en más de 8 segundos, al del control
• Se emplea para detectar déficits de la vía intrínseca, para el control de los tratamientos con anticoagulantes y terapias con heparina

 
 
https://www.google.es/search?q=cefalina&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=w2sFVZbjN4LuUv
W2g-gL&ved=0CAYQ_AUoAQ#tbm=isch&q=erase+una+vez+coagulacion&imgdii=_&imgrc
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HOJA DE TRABAJO

A) ¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p?
A partir de cerebros de conejos

B) ¿Cómo se llama el sustituto de f3p?
Cefalina

C) ¿Qué activadores de los factores de contacto se pueden utilizar?
Caolín, polvo de vidrio, sílice, celite y ácido elágico

D) ¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al del control para ser considerado anormal?
8 segundos