PRACTICA XXXVII (4/03/15)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA)

 

INTRODUCCIÓN

Tiempo que tarda en coagular un PPP, tras su recalcificación y en presencia de un sustituto de f3p
La recalcificación se realiza mediante la adición de una solución de cloruro cálcico (CaCl2), el sustituto consiste en una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejos (cefalina)
Factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias: caolín, polvo de vidrio, sílice, celite y ácido elágico
Muestra: plasma pobre en plaquetas (PPP)


MATERIAL

• Gradilla
• 2 cubetas de coagulómetro
• 2 trocitos de acero
• Pipeta automática (100 microlitros)
• Puntas de pipeta amarillas
• Coagulómetro

• Baño de agua 37ºC
• 4 tubos de ensayo de plástico

REACTIVOS

• Solución cloruro cálcico 0,025 M
• Cefalina activada con ácido elágico
• Pool de plasmas normales o un plasma control normal

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Homogeneizar reactivos y muestra, sin agitarlos bruscamente
• Depositar volumen necesario
• Atemperar: 37ºC durante 5 a 15 minutos
• Introducir trocito de acero en cada una de las cubetas
• Tubo con letra M (muestra) y otro con letra C (control)
• Verter  100 microlitros de muestra : cubeta M
• Verter 100 microlitros de plasma control normal : cubeta C
• Añadir 100 microlitros de cefalina activada
• Mezclarlo bien
• Incubar a 37ºC durante 2 minutos, placa calefactora
• Colocarla y agregar 100 microlitros de CaCl2 0,025 M
• Al agregarlo se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comieza su lectura
• Cuando se forma el coágulo finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de CaCl2

OBSERVACIÓN

• TTPA: adición CaCl2 hasta la formación coágulo de fibrina
• Lo más correcto es determinar 2 veces y hacer su media correspondiente
• Nomrla: 30 y 40 segundos, tiempo superior se considera alargado, y también es anormal un TTPA de la muestra superior, en más de 8 segundos, al del control
• Se emplea para detectar déficits de la vía intrínseca, para el control de los tratamientos con anticoagulantes y terapias con heparina

 
 
https://www.google.es/search?q=cefalina&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=w2sFVZbjN4LuUv
W2g-gL&ved=0CAYQ_AUoAQ#tbm=isch&q=erase+una+vez+coagulacion&imgdii=_&imgrc
=V4Xzct3FQ4k7uM%253A%3BAAi6nSOu3AFEOM%3Bhttp%253A%252F%252Fi.ytimg.com%252Fvi%252F0kW7kEVeWUM%252Fmaxresdefault.jpg%3Bhttp%253
A%252F%252Fwww.youtube.com%252Fwatch%253Fv%253D0kW7kEVeWUM%3B1280%3B720

HOJA DE TRABAJO

A) ¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p?
A partir de cerebros de conejos

B) ¿Cómo se llama el sustituto de f3p?
Cefalina

C) ¿Qué activadores de los factores de contacto se pueden utilizar?
Caolín, polvo de vidrio, sílice, celite y ácido elágico

D) ¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al del control para ser considerado anormal?
8 segundos

Tiempo de coagulación (2/03/15)

INTRODUCCIÓN

Es el tiempo que tarda en generarse un coágulo en una muestra de sangre no anticoagulada, que se pone en contacto con una superficie de vidrio
Muestra de sangre en fresco

MATERIAL

• Lancetas
• Gasas
• Capilar (azul)
• Baño maria a 37ºC

REACTIVOS

• Alcohol

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Desinfectar bien la punta del dedo
• Pinchar con lanceta
• LLenar 1/3 del capilar azul
• Se sitúa la muestra en el baño maría a 37ºC
• Moverlo dentro de éste hasta que coagule y mirar el tiempo transcurrido

OBSERVACIÓN

• El tiempo de coagulación depende de numerosas variables (el volumen de la muestra que analiza y la superficie del tubo que entra en contacto con la sangre) para su determinación reproductible, la técnica empleada ha de estar perfectamente estandarizada
• Valores normales: 5 a 10 minutos
• Este estudio permite la detección de trastornos relacionados con la vía intrínseca con la vía común de la coagulación
• Alarmiento en: déficits de factores de la vía intrínseca (hemofilia), situaciones de afibrinogenemia y fibrinolisis excesiva, terapias con heparina, esta prueba puede utilizarse en el control de los tratamientos heparínicos
• Esta prueba es poco sensible, ya que no detecta déficits ligeros de factores, por lo que está en desuso

(Nota: el día 2 falté, y no la he realizado en laboratorio, por lo que no tengo ni fotografías ni el tiempo realizado, me enteré el último día que esta práctica estaba realizada por lo que la pongo la útlima ya que todas las otras están subidas)

Curva fibrinógeno (práctica XL)

Curva actividad protrombina (práctica XXXIX)

Curva electroforesis (práctica XXXI)

PRACTICA XLI (10/03/15)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL

 

INTRODUCCIÓN

Se realizan cuando tiempos determinados en el plasma problema (TTPA) está alargado
Se mezclan a partes iguales el plasma problema y plasma que se sabe que es normal, y se incuba 37ºC durante 60 minutos
Si los tiempos determinados en la mezcla se corrigen, falta algún factor en el plasma problema y su carencia ha sido compensada con el aporte suplementario de factoes contenidos en el plasma o en suero normales
La prueba de mezcla se practica con plasma normal, cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado, aquí se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y de los factores VIII, IX, XI o XII
Se mezlca a partes iguales el PPP problema con PPP normal, y se repite la determinación del TTPA, pero no en el PPP problema puro, sino en la mezcla preparada, tras lo cual, se incuba la mezca a 37ºC durante 60 mintuos
Si el TTPA en la mezcla se corrige, falta en el plasma problema alguno de los factores de la vía intrínseca que sin embargo, sí está presente en el PPP normal
Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como actuación d esustancias inhibidoras de la coagulación
Muestra: plasma pobre en plaquetas (PPP)  y un TTPA anómalo, es decir, alargado
A partir del PPP anómalo hay que preparar una dilución 1/2 con el pool de plasmas normales o con el plasma contro normal

PPP ANÓMALO: 100 microlitros
Pool de plasmas normales o plasma control normal: 100 microlitros
Dilución: 1/2
Dilución incubar 37ºC durante 60 minutos

MATERIAL

• Gradilla
• 2 cubetas coagulómetro
• Coagulómetro
• Pipeta 100 microlitros
• 4 puntas de pipeta
• Baño de agua 37ºC
• 3 tubos de ensayo de plástico

REACTIVOS

• Solución de cloruro cálcico 0,025 M
• Cefalina activada con ácido elágico
• Pool de plasmas normales o un plasma control normal

Imagen realizada en el laboratorio


TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Homogeneizarlos
• Depositar el volumen necesitado en 3 tubos de ensayo de plástico
• Atemperar los reactivos a 37ºC durante 5 a 15 minutos
• 2 cubetas de coagulómetro e introducir sus trozitos de acero
• Roturarlas con M1 y M2
• Verter 100 microlitros de la dilución de la muestra en cada cubeta
• Añadir 100 microlitros de cefalina activada
• Mezclarla bien mediante la pipeta automática
• Incubarla 37ºC durante 2min (coagulómetro)
• Colocarlas e introducir 100 microlitros de CaCl2 0,0025 M
• Al agregarla comienza la lectura y cuando se forma el coágulo  nos ofrece el tiempo transcurrido en la pantalla

Imagen realizada en el laboratorio


OBSERVACIÓN

• Valores normales: 30 y 40 segundos
• Un tiempo superior se considera alargado
• Como el TTPA de la dilución de la muestra se determina dos veces, se calcula la cifra media de esta pareja d valores, este valor medio es el resultado final de la determinación
• TP normal y TTPA alargado: trastorno vía intrínseca
• En este caso se incuba la mezcla de plasma y cefalina activada durante 15 mintuos, si con este cambio se corrige el alargamiento del TTPA, se torna normal y hay un déficit de PK
• SI tras aumentar el tiempo de incubación, no se corrige, tiene que hacerse una prueba de mezcla con plasma normal
• Si tras la mezcla con plasma normal se corrige, deja de estar alargado, es porque falta algún factor de la vía intrínseca (VIII, IX,, XI XII) en la muestra y su carencia ha sido compensada con el aporte suplementario de factores contenidos en el plasma normal
• Si, tras la mezca con plasma normal, no se corrige el TTPA, se debe investigar la presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación (heparina, PDF, inhibidor tipo lupus,etc )

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?
Cuando aumenta el TTPA tras ser incubado y no se corrige

B) Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿qué se debe investiar?
Presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación


RESULTADOS OBTENIDOS

Hemos utilizado el plasma control de un compañero tras su extracción de sangre venosa
Resultados: tiempo 20,7 y ratio 0,74

PRACTICA XLI (9/03/15)

 

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE FIBRINÓGENO

 

INTRODUCCIÓN

El fibrinógeno en presencia de exceso de trombina se transforma en fibrina
El tiempo de formación del coágulo es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente en el plasma
La determinación de fibrinógeno por el tiempo de coagulación de trombina, está basada en el método descrito por Clauss
En presencia de altas concentraciones de trombina, el tiempo necesario para la fomación del coágulo en el plasma diluido es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno
Factor I (fibrinógeno) proteína sintetizada en el hígado, componente de la sangre utilizado para formar el coágulo
Su determinación nos ayuda a evaluar las alteraciones en los mecanismos de coagulación
Se incrementa en inflamaciones agudas y embarazo
Valores bajos en terapias trombolíticas, enfermedades hepáticas, disfrinogenia congénita, DIC y pancrealitis
La muestra es plasma obtenido por punción venosa diluido 1/10 en solución citrato trisódico 3,8%
Mezclar la sangre con el anticoagulante
Centrifugar la muestra a 3000 rpm/10min


MATERIAL

• Coagulómetro

Imagen realizada en Laboratorio

• Baño a 37ºC
• Equipamiento habitual de laboratorio

REACTIVOS

• R1 (reconstituir con 2ml de agua destilada), R2(agitar antes de su uso) y R3 (listo para su uso)

Imagenes realizadas en Laboratorio

TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Preparar dilución 1/10: 50 microlitros muestra + 450 microlitros de R2 (tampón imidazol)

                  TUBO 1             T2             T3            T4            T5

Dilución
Calibrador     1/40               1/30          1/20         1/10        1/5

R2 (ml)           3,9                 2,9            1,9           0,9         0,4

COAGU
LATION         0,1                0,1             0,1          0,1         0,1
CAL
(ml)

• A 0,2 ml de cada dilución añadir 20 microlitros de R3
• Atemperar a 37ºC durante 4-6minutos
• Añadir 0,1 ml de R1 (pone fibrinógeno) y cronometrar la formación de coágulos
• No atemperar la trombina R1

 

 

 

 

Imagenes realizada en Laboratorio


OBSERVACIÓN

• Calcular la media de los duplicados de los tiempos de coagulación, despues de finalizar la reacción. Utilizar los cinco puntos del calibrados para crear una curva de los tiempos obtenidos en segundos, frente a los valores de concentración de fibrinógeno de cada dilución del caloibrador (mg/dl)
• Trazar la mejor curva, examinarla y omitir los puntos no lineales, la curva final debe constar de tres puntos consecutivos como míimo. La creación de la curva solo con los puntos mas lineales producirá la mejor recuperación en los controles y las muestras de paciente
• La siguiente curva de calibración es sólo orientativa, variando en función del lote y concentración del calibrador, así como del instrumento utilizado
• La dilución 1/10 del plasma representa el 100% del valor asignado
• Valores orientativos: 200-400 mg/dl (2-4 g/L)

RESULTADOS OBTENIDOS

DILUCION           CONCENTRACIÓN (mg/dl)             TIEMPO
    
      1/5                                478                                      11,7 (ratio 0,42)
      1/10                              239                                      15,6 (ratio 0,56)
      1/20                             119,5
      1/30                             78,87
      1/40                             59,75                                   46,9 (ratio 1,67)
   Muestra                           42,3                                             (ratio 1,51)

(Nota: las diluciones que no tienen indicadas su tiempo, es porque el día de la práctica realizada el coagulómetro daba valores muy altos; 200... y no lo anotamos)

Imagen de la curva correspondiente a fibrinógeno en papel (no se aprecia pero he realizado varias fotos y al subirlas se cambia y se aprecia así, está bien realizada en papel)

 

PRACTICA XL (6/03/15)

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

 

INTRODUCCIÓN

Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en % de actividad (Indice de Quick)
Para ello es necesario preparar una curva de actividad de protrombina e interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP en el plasma problema
Se prepara una batería de diluciones a partir de un plasma contro normal y se mide el TP del plasma control normal no diluido y de cada una de las diluciones, se asigna el 100% de actividad al número de segundos medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el % que les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones
Con todos estos datos se traza una curva de calibrado anotando en el eje vertical los valores en segundos del TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones y en el eje horizontal el % de actividad asignado a cada uno de ellos

MATERIAL

• 8 tubos de ensayo de plástico
• Prepipeta
• Pipeta graduada de vidrio de 1ml (1000 microlitros)
• Pipeta para 100 y 200 microlitros mas 7 puntas de pipeta (amarillas)
• 5 cubetas  coagulómetro
• 5 trocitos de acero
• Coagulómetro
• Baño de agua a 37ºC
• Hoja milimetrada, regla, boli
• Gradilla

REACTIVOS

• Solución salina al 0,85% ( Dietil-barbiturato de sodio 2,94g, acetato de sodio 1,94g, y agua destilada 100ml)
• Tromboplastina cálcica
• Pool de plasmas normales o plasma control normal

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Homogeneizar la tromboplastina cálcica y las diluciones del plasma sin agitarlas bruscamente
• Depositar el volumen total de tromboplastina cálcica en un tubo de ensayo de plástico

                          TUBO 1          T 2        T 3            T 4             T5

Pool de plasmas     200             200        200           200             200
o plasma contro
(microlitros)

Solución salina
al 0,85%
(microlitros)           0                200         400           600             1800

Dilución               1/1               1/2          1/3            1/4               1/10

% de actividad     100              50            33             25                  10

• Atemperar la tromboplastina cálcica a 37ºC entre 5 o 15minutos
• Introducir acero
• Rotular los tubos con sus correspondientes diluciones
• Verter 100 microlitro de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas en el % de actividad que les corresponde
• Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37ºC entre 3 y 5 minutos, pueden depositarse en la placa calefactora del coagulómetro
• Colocar cada una de las 5 cubetas en la celda de medida del coagulómetro y agregar 200 microlitros de tromboplastina cálcica, al agregarla se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza su lectura
• Cuando se forma el coágulo, el coagulometro sinaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica

OBSERVACIÓN

• Lo más correcto es determinar 3 veces el TP del plasma control puro y de cada una de sus diluciones y dar como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?
Agua destilada

B) ¿Qué % de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?
50%

C) ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?
Cuando se agrega el RT

D) ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?
Los valores en segundos de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones

RESULTADOS OBTENIDOS

1/1 = 5,4
1/2 = 32,2
1/3 = 45
1/4 = 49,4
1/10 = 101,9

PRACTICA XXXIX (5/03/15)

 

PRUEBA DE RUMPEL-LEEDE

INTRODUCCIÓN

Esta prueba consiste en evaluar la resistencia que ofrecen las paredes capilares al aumento de la presión intracapilar y la anoxia, se aplica un torniquete en el brazo durante un tiempo determinado, esto originará presión intracapilar y una anoxia que son los responsables de la posible producción de extravasaciones sanguíneas, visibles en forma de petequias

MATERIAL

• Esfignomanómetro
• Fonendoscopio
• Reloj

TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Observar la posible presencia de petequias en la extremidad superio antes del comienzo de la prueba
• Medir la presión arterial del paciente en su otra extremidad superior y calcular la media entre la presión arterial sistólica y la diastólica
• Trazar un círculo de unos 5 cm de diámetro en la cara anterior del antebrazo elegido y a unos 5 cm de la flexura del codo
• Colocar el manguito del esfigmomanómetro en el brazo seleccionado
• Insuflar aire en el interio del manguito del esfignomanómetro hasta ejercer una presioón sobre el brazo equivalente a la presión arterial media del enfermo que previamente se ha medido
• Mantener esa presión durante 5 minutos
• Aflojar y retirar el manguito del esfigmomanómetro
• Contar el número de petequias que han aparecido en el interior del círculo

OBSERVACIÓN

• Se aprecian como pequeñas manchas cutáneas de color rojizo constituidas por acúmulos de sangre y que no desaparecen aunque se haga presión
• Sólo hay que tener en cuenta las petequias que haya mientras la realización de la prueba
• Negativo: menos de 10 petequias
• Positivo: más de 20
• Y dudoso cuando oscila entre 10 y 20
• Si la aparición de numerosas petequias solo se ve en la cara anterior del antebrazo la prueba es débilmente positiva pero si se extiende a otras zonas de la extremidad superior la prueba es medianamente positiva y si las petequias tienden a confluir, la prueba es fuertemente positiva
• Positiva: ascenso de la fragilidad capilar, en las trombocitopenias, en la enfermedad de von Willebrand, en el escorbuto y en las púrpuras vasculares

https://www.google.es/search?q=test+de+howell+laboratories&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=is
ch&sa=X&ei=isIBVefHCIT3avntgaAN&ved=0CAYQ_AUoAQ#tbm=isch&q=petequias&imgdii=_

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Cuánto tiempo se deja puesto el esfigmomanómetro en esta prueba?
5minutos

B) ¿Cómo se aprecian las petequias?
Pequeñas manchas cutáneas de color rojizo

C) ¿Cuántas petequias debe contener el círculo para que el resultado sea positivo?
Más de 20

D) ¿En qúe enfermedades hay una prueba de Rumpel-Leede positiva?
Ascenso de la fragilidad capilar, en las trombocitopenias, en la enfermedad de von Willebrand, en el escorbuto y en las púrpuras vasculares

PRACTICA XXXVIII (5/03/15)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)

INTRODUCCIÓN

El TP es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística (procede extractos de cerebro o pulmón de hombre o animales, generalmente de conejo o vaca)
Los factores extrínsecos de la coagulación se activan en presencia de tromboplastina cálcica en plasma citratado, el proceso de medición del tiempo de protrombina en una etapa única, mide el tiempo de coagulación del plasma después de la adición del reactivo
También llamado tiempo de Quick ha servido para determinar trastornos de la coagulación la PT es la determinación más frecuente junto con la APTT
La PT es sensible a las anomalías de los factores extrínsecos de la coagulación (factor II, V, VII, X y fibrinógeno) así como sus inhibidores, es además un indicador en enfermedades hepáticas
Se utiliza para la monitorización de las terapias con anticoagulantes
La muestra es plasma obtenido por punción venosa diluido 1/10 en solución de citrato trisódico 3,8%, mezclar la sangre con el anticoagulante, evitando la formación de espuma
Centrifugar la muestra a 1500 x g 15min y transferir el plasma a contenedores de vidrio siliconado o plástico
Los plasmas turbios, ictéricos, lipémicos o hemolizados pueden dar resultados erróneos
La muesstra es estable 2horas a temperatura ambiente (15-25ºC) o 4 horas a 2-8ºC
No usar como anticoagulantes oxalato sódico, EDTA o heparina


MATERIAL

• Gradilla
• Cubeta coagulómetro
• Trocitos de acero para depositr dentro de cada cubeta
• Pipeta automática para dispensar 100 y 200 microlitros
• 2 puntas de pipeta para contener 100 y 200 microlitros (amarillas)
• Coagulómetro

Imagen realizada en el Laboratorio

• Baño de agua 37ºC
• 2 tubos de ensayo de plástico

REACTIVOS

• R: tromboplastina calcica liofilizada, extracto de acetona deshidrata de cerebro de conejo y CaCl2. Tampón y conservantes
• Opcional: Control normal y contro pathologic
• RT: reconstituir el contenido con 4ml de agua destilada, mezclar hasta disolver su contenido e incubar 15 min a temperatura ambiente

La sensibilidad de todas las TH comerciales se compara con la de una TH de referencia internacional, se expresa por Índice de Sensibilidad Internacional (ISI), cuanto menor es el ISI de la TH comercial, mayor es su sensibilidad
El ISI de cada reactivo de tromboplastina cálcica comercial puede ser diferente y puede variar de un lote a otro, por lo que debe mirarse en el folleto de instrucciones que se adjunta a cada envase
La tasa de PT (PR) se puede convertir  a su correspondiente valor internacional usando el índice internacional de sensibilidad (ISI), así se obtiene la tasa normalizada internacional INR

TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Calentar a 37ºC el RT y la muestra

Imagen realizada en el Laboratorio

• RT: mezclar 200 microlitros
• Incubar 5min a 37ºC
• Pipetear plasma citratado 100 microlitros
• Poner en marcha el coagulómetro medir el tiempo de formación del coágulo, inmediatamente después de la adición del reactivo

OBSERVACIÓN

• Los valores se expresan en %, también en segundos pero lo haremos de forma de porcentaje

INR= TP del plasma del paciente/ TP de plasma control normal elevado ISI

 

• El TP es el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina
• INR cociente corregido con el ISI de la tromboplastina hística
• El valor en segundos del TP determiando en la muestra se interpola en la curva de actividad de la protrombina preparada, y se halla el porcentaje de activiad de la protrombina que le corresponde
• El resultado puede expresarse en forma de cociente o proporción (ratio) entre el valor, en segundos del TP de la muestra y de plasma control normal no diluido
• Valores normales: 11 y 15 segundos
• % de actividad de la protrombina de plasma normal oscila entre 70 y 100%
• La ratio de protrombina normal 0,9 y 1,15
• El tiempo de protrombina está alargado, el % de actividad disminuido y la ratio aumentada en pacientes con déficits de factores de la vía extrínseca, en enfermos sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes con trastornos hepáticos

 

HOJA DE TRABAJO

 

Hemos obtenido 5,1 y de ratio 0,18

PRACTICA XXXVI (3/03/15)

DETERMINACIÓN DEL TEST DE HOWELL

INTRODUCCIÓN

Es la prueba que mide el tiempo que tarda en coagularse un PRP (plasma rico en plaquetas), obtenido a partir de una muestra de sangre con citrato, cuando se vuelve a recalcificar
Se vierte el PRP en un tubo de vidrio, se le añade una solución de cloruro cálcico y se incuba a 37ºC
El resultado del test de Howell es el tiempo transcurrido desde la adición del CaCl2 al PRP hasta la coagulación de éste


MATERIAL

• 2 tubos de hemólisis de vidrio
• 4 pipetas graduadas de vidrio de 0,1 ml
• Baño de agua a 37ºC
• Cronómetro

REACTIVOS

• Solución acuosa de cloruro sódico a una concentración del 0,85% p/v (solución salina al 0,85%)
• Solución de cloruro cálcico 0,025 M (CaCl2 anhidro 0,28g y agua destilada 100ml)
• Plasma control normal

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Atemperar muestra y reactivos a 37ºC en el baño de agua durante 5 a 15 minutoa
• Rotular un tubo con la letra M (muestra) y otro con la letra C (control)
• Introducir los dos tubos en el baño ajustándolo a 37ºC
• Depositar 0,1 ml de muestra, en el tubo M, y 0,1 ml de control comercial o de pool de plasmas en el tubo C
• Añadir 0,1 ml de solución salina al 0,85% al contenido de cada tubo
• Agregar 0,1 ml de CaCl2 0,025 M, y poner en marcha los cronómetros
• Coger los tubos por su extremo superior y sin sacarlos del agua inclinarlos suavemeente hacia delante y hacia atrás a un ritmo de inclinación por segundo
• Parar el cronómetro cuando se vea la aparición de un enturbiamiento y de una solidificación de la mezcla de plasma y reactivos contenida en cada uno de los tubos

OBSERVACIÓN

• Si la muestra es normal el resultado dle test de Howell debe coincidir con el resultado del test efectuado con el control
• Valores normales comprendidos entre 90 y 130 segundos
• Tiempo mayor: déficits de factores de la vía intrínseca, hemofilia, en situaciones de afibrinogenemia y de hiperfibrinolisis y en terapia con heparina

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Qué tipo de muestra se utiliza en esta prueba?
Plasma rico en plaquetas

B) ¿A qué concentración está el CaCl2 empleado en el test?
0,85% p/v

C) ¿Cuáles son los valores normales del test de Howell?
De 90 a 130 segundos

D) ¿Qué tratamiento puede ser controlado con este test?
Situaciones afibrinogenemia y de hiperfibrinolisis y en terapias con heparina

PRACTICA XXXV (2/03/15)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE HEMORRAGIA CON LA TÉCNICA DE DUKE

INTRODUCCIÓN

El tiempo de hemorragia es el tiempo que transcurre desde la sección de un grupo de capilares hasta la formación del trombo blanco plaquetario, se determina efecuando una pequeña herida en la piel y midiendo el tiempo que tarda en cesar de manar sangre a través de la herida

MATERIAL

• Algodón
• Portaobjetos
• Lanceta
• Cronómetro
• Un trozo de papel de filtro limpio circular

REACTIVOS

• Alcohol, desifectante eficaz

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Limpiar el lóbulo de la oreja con un algodon embebido en desinfectante pero sin frotar en exceso, dejar que se seque
• Pinchar el lóbulo de la oreja cerca de su borde inferior y poner en marcha el cronómetro
• Sin hacer presión, dejar que salga sangre del lóbulo
• Recojer con papel de filtro cada 30 segundos la gota de sangre que se presente en el lóbulo, para hacer esto, no se debe tocar la herida con el papel de filtro, para evitar que se rompa el trombo plaquetario que se está formando
• Desplazar un poco el papel de filtro, entre cada recogida de sangre, para que las gotas de éstas no coincidan sobre una misma zona, cada vez que pasa el tiempo, más pequeñas son las gotas recogidas

https://www.google.es/search?q=tecnic+de+duke&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=eFIBVcqSOIOK
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OBSERVACIÓN

• Se puede calcular multiplicando el número de manchas de sangre por 30 segundos, la hemorragia se cohíbe espontáneamente en 1 a 3 minutos
• El tiempo de hemorragia está alargado en las púrupues vasculares, en las trombocitopenias, en las trombopatías congénitas, en la enfermedad de von Willebrand y en los sujetos que han tomado ácido acetilsalicílico

HOJA DE TRABAJO

A) ¿De quíen es la técnica que se utiliza para determinar el tiempo de hemorragia?
Duke

B) ¿Cada cuánto tiempo se recoge la gota de sangre que está presente en el lóbulo de la oreja?
30 segundos

C) ¿Cuál es el tiempo de hemorragia normal?
1 a 3 mintuos

D) ¿Qué fármaco aumenta el tiempo de hemorragia?
Ácido acetilsalicílico

(Nota: el día 2 de marzo falté y la realizé el dia 3/03/15)

RESULTADOS OBTENIDOS

Número de manchas de sangre que han quedado marcadas en el papel de filtro:
4 gotas

Tiempo transcurrido, desde que se ha puesto en marcha el cronómetro hasta que se ha parado:
2,5minutos

VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS

El tiempo de hemorragia obtenido es: Normal

PRACTICA XXXIV (2/03/15)

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

INTRODUCCIÓN

No realizada el día 2 por la ausencia en clase, pero repetida día 3/03/15
La membrana de los glóbulos rojos tiene una carga electrostática negativa (potencial zeta), ésta da lugar a unas fuerzas de repulsión entre los hematíes que hacen que los eritrocitos tiendan a permanecer en suspensión
Con el tiempo, los glóbulos rojos acaban depositándose debido a la fuerza de la gravedad en el fondo del recipiente que los contiene
3 Fases:

• Fase inicial de agregación: comienza el apilamiento de los eritrocitos y se produce una sedimentación lenta de los mismos (10min)
• Fase de sedimentación rápida: apilamiento y sedimientación se produce a una velocidad alta y constante (40min)
• Fase final de concentración: la sedimentación se enlentece (hasta el final de la segunda hora)

Imagenes realizadas en el Laboratorio

VSG: medición de la rapidez con la que sedimentan los hematíes en la muestra
Cuando los eritrocitos pueden sedimentar con mayor facilidad la VSG aumenta
VSG, los glóbulos rojos tienen a ir cayendo a favor de la fuerza de la gravedad, hacia el inferior del tubo este proceso es lento, pues la fuerza con la que es atraído cada hematíe hacia el fondo del tubo es casi compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba
VSG, equivale a la longitud del recorrido que desciende la columna de eritrocitos, desde la parte superior del tubo hacia abajo, en un intervalo de tiempo
La muestra sangre venosa anticoagulada
Lo ideal es recoger la sangre en tubos mezcladores, que contienen 0,4ml de citrato sódico al 3,8% y al que se añade sangre venosa problema, hasta el nivel de 2ml marcado en el tubo mezclador, si sólo se dispone de sangre anticoagualada con EDTA, se puede utilizar una mezcla de 2ml de sangre con 0,5ml de citrato sódico al 3,8% o con 0,5ml de cloruro sódico al 0,85%
Lo importante es que la muestra esté libre de hemólisis

MATERIAL

• Sistema Eritrosed, consta de:

-Pipetas desechables de vidrio, en su interior albergan un émbolo de aspiración de plástico blanco
-Gradilla especial, con unas perforaciones en su base, paa situar los tubos mezcladores, y en su parte superior y media, permiten soportar verticalmente las pipetas al ser atravesadas por éstas, consta de una corredera superior para atrapar las puntas de los émbolos

• Tubos mezcladores de polipropileno con tapones de goma perforable
• Reloj

https://www.google.es/search?q=hematie+fragilidad&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=OzD8VO
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REACTIVOS

• Se recomienda el citrato sódico al 3,8% que esté contenido en tubos mezcladores apropiados, pero también se puede utilizar el EDTA, no la heparina pues altera el potencial zeta de los hematíes, ni los oxalatos, pues encogen las células sanguíneas

TÉCNICA O PROCEMIENTO

• Hacerlo a temperatura ambiente, ya que si es mayor asciende la VSG y si es menos, disminuye (debido a que aumenta la viscosidad de la sangre)
• 1ml vertemos de sangre en el tubo del tapón negro
• Lo movemos para homogeneizar
• Se introduce la pipeta especial con la punta azul clara
• Por capilaridad asciende a 0, para que deje de subir basta con dejar de introducir la pipeta en el tubo
• Se deja 1h, se toma la medida, porque baja
• Se deja otra hora y se vuelve a medir
• Es muy importante que la pipeta esté muy vertical
• En el reposo no puede ser afectada por vibraciones

Con el paso del tiempo se delimita una zona de separación entre la columna de eritrocitos y el plasma

• Al final del tiempo de lectura previsto, se mira en la escala graduada de la pipeta, la marca que coincide con el límite de separación entre los hematíes y el plasma
• Resultado expresado en:

-Longitud en mm del recorrido descendente de la columna de glóbulos rojos en una hora (VSG de la primera hora) y en dos horas (VSG de la segunda hora)
-Índice de Katz, fórmula:

 

Índice de Katz=    VSG 1ªh + VSG 2ªh/2 

                         ______________________

 

                                        2

   Valores normales:

• Varones: en 1ªh 2-7mm, 2ªh 8-15mm
• Mujeres: en 1ªh 3-10 mm, 2ªh 12-20mm

índice de katz, el valor normal oscila entre 2 y 16

• La VSG varía, es más alta en la mujer y aumenta en la vejez y a partir del tercer mes del embarazo, los valores volvería a su normalidad un mes después del parto
• VSG alta en neoplasias malignas de las células plasmáticas
• VSG baja enfermades autoinmunes
• El número, tamaño y forma de los glóbulos también altera la VSG

HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿Cómo se llama la carga electrostática negativa de los glóbulos rojos?

Potencial zeta

 

B) ¿Qué anticoagulante es el más apropiado para realizar una determinación de VSG?

Citrato sódico o EDTA

 

C) ¿ A qué temperatura se recomienda practicar la determinación de VSG?

20-25ºC

 

D) ¿A qué tiempos se efectúa la lectura de la VSG?

Cada 1h y despues otra hora

 

E) ¿En qué circunstancias fisiológicas aumenta la VSG?

Anemias

 

RESULTADOS OBTENIDOS

 

Sexo del paciente: Varón

Valor de la VSG a la 1ªh: 0,4

Valor de la VSG a la 2ªh: 0,2

Índice de Katz= 0,4 + 0,2/2  /2 

 

https://www.google.es/search?q=hematie+fragilidad&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=OzD8VO

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PRÁCTICA XXXIII (27/02/15)

 

PRUEBA DE LA SACAROSA

INTRODUCCIÓN

Situar los hematíes problema en un medio de baja fuerza iónica (solución sacarosa), los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que los glóbulos rojos presentes en la muestra tienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento tienden a sufrir la acción de éste, y a lisarse
Muestra sangre venosa completa y anticoagulada con EDTA, por ejemplo
Hemos cogidos dos muestras diferentes, sangre control y sangre problema

MATERIAL

• Pipetas pasteur
• Pipetas graduadas ( 1 de 5ml, 2 de 2 ml, 3 de 0,5ml)
• Pipeta automática (100 microlitros) para hacer 0,1 ml
• 6 tubos de centrífuga
• Reloj
• Centrífuga
• Espectrofotómetro
• Cubetas de espectrofotómetro
• Gradilla

REACTIVOS

• Solución acuosa de sacarosa (azúcar) a una concentración del 9,24%
• Sangre control (extraída recientemente)
• Solución acuosa de amoniaco a una concentración del 0,04%

-0,2ml de hidróxido amónico (NH4OH) al 20%
-99,8ml de agua destilada

• Suero fisiológico (solución salina al 0,9%)

https://www.google.es/search?q=hematie+fragilidad&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=OzD8VOq

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TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• 3 Tubos: uno con las siglas SF (suero fisiológico), otro SC (sangre control) y SP (sangre problema)
• Rellenar con:

Tubo SF: 1,8 ml de suero fisiológico + 0,2 ml de sangre problema

Tubo SC: 1,8 ml de solución sacarosa + 0,2 ml de sangre control

Tubo SP: 1,8 ml de solución sacarosa + 0,2 ml de sangre problema

• Agitar los tubos
• Dejarlos a temperatura ambiente durante 30minutos
• Centrifugar a 2000 rpm/5min

OBSERVACIÓN

• Su lectua puede ser visual o espectrofotométrica
• NO HEMÓLISIS: se observa un botón sedimentario rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente
• SÍ HEMÓLISIS: cuando se advierte la presencia de un líquido rojizo y transparente, en los tubos SF Y SC no tiene que haber hemólisis, ya que estos tubos funcionan como controles negativos
• Lectura espectrofotométrica:

Tubo TB (tubo blanco): 5ml de solución de amoniaco + 0,3ml de suero fisiológico

Tubo TPr (tubo problema): 5ml de solución de amoniaco + 0,3 ml de sobrenadante del tubo SP

Tubo TPa (tubo patrón): 5ml de solución de amoniaco + 0,3 ml líquido resuspendido del tubo SF

• Se utiliza el líquido del tubo blanco para poner el aparato a 0 de A, y el líquido del tubo patrón se emplea para determinar la A que corresponde a un 100% de hemólisis
• Fórmula:

% de hemólisis= A/Am x 100



 

(A: absorbancia del líquido presente en el tubo problema, Am: absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón )

• La prueba de la sacarosa suele ser positiva en la HPM, en esta enfermedad su grado de positividad es de 10-80% de hemólisis
• Es negativa en la diseritropoyesis congénita tipo II (HEMPAS)

HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿A qué concentración se prepara la solución de sacarosa?

9,24%

 

B) ¿Cómo se llama la sacarosa?

Azúcar común

 

C) ¿Cómo se prepara el tubo blanco?

5ml de solución de amoniaco + 0,3 ml de suero fisiológico

 

D) ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, en la sangre de la HPN?

10-80% de hemólisis

 

RESULTADOS OBTENIDOS

 

TB= 0,155

TPr= 0,115

TPa= 0,121

 

https://www.google.es/search?q=hematie+fragilidad&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=OzD8VOqe

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PRACTICA XXXII (25/02/15)

ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS HEMATÍES

INTRODUCCIÓN

El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil
Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de Hb que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis)
Condiciones normales: un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen un 70% como máximo
Esta prueba evalúa la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de su contenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE, que puede variar de unos a otros en la misma sangre)
La muestra es sangre venosa completa y anticoagulada (anticoagulante: heparina)
No deben haber pasado más de 2h desde la extracción de la sangre hasta su utilización, en el caso de que la muestra se haya conservado a 4ºC puede prolongarse este tiempo a 6h

 

https://www.google.es/search?q=hematie+fragilidad&biw=1280&bih=705&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=OzD8VOqeA

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MATERIAL

• Pipetas Pasteur
• Tubos de centrífuga
• Reloj
• Centrífuga
• Espectofotómetro
• Cubetas de espectofotómetro
• Gradilla

REACTIVOS

• Suero fisiológico, preparándose:

9g de cloruro sódico
2,7 de fosfato sódico di-básico
0,2 de fosfato sódico mono-básico
1000ml de agua destilada

• Agua destilada

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Prepara batería de soluciones de cloruro sódico: (hemos utilizado 8 tubos preparando los 4 primeros y los 4 últimos)

Tubo 1: 0 gotas de agua destilada, 18 gotas de suero fisiológico, 9 concentración obtenida (g/dl)
Tubo 2: 1      "          "         "           17    "           "             "         8,5           "               "
Tubo 3: 2      "          "          "          16    "           "             "           8            "                "
Tubo 4: 3      "          "         "           15   "          "             "          7,5           "               "
Tubo 5: 4      "          "          "          14   "           "              "           7           "                 "
Tubo 6: 5      "           "         "          13   "          "              "         6,5          "                 "
Tubo 7: 6      "          "         "           12    "          "            "            6             "               "
Tubo 8: 7      "           "        "           11     "           "           "          5,5          "                "
Tubo 9: 8      "          "         "           10      "         "            "           5           "                 "
Tubo 10:9     "          "         "            9       "         "            "           4,5        "                 "
Tubo 11: 10             "          "            8       "         "          "             4           "                 "
Tubo 12: 11             "          "            7       "         "           "            3,5        "                 "
Tubo 13: 12             "          "            6      "          "          "               3         "                "
Tubo 14: 13            "           "            5      "          "           "           2,5         "                 "
Tubo 15: 14           "            "            4      "          "           "             2           "                "
Tubo 16: 15            "           "            3      "          "            "          1,5        "                   "
Tubo 17: 16            "          "             2      "          "            "            1          "                 "
Tubo 18: 17            "          "             1      "          "             "        0,5         "                  "

• Añadir a cada tubo 50 microlitros de sangre completa ( debe hacerse de forma que la gota llegue a la solución de cloruro sódico sin que toque la pared interna del tubo)
• Agitar los tubos
• Dejar los tubos en reposo 30 minutos a temperatura ambiente
• Centrifugar los tubos a 2000 rpm/5min o dejarlos en reposo durante 3 horas

OBSERVACIÓN

• Aquí observamos la presencia o ausencia de hemólisis en los tubos, utilizaremos el espectofotómetro
• Lectura visual: se considera que no hay hemólisis cuando en el tubo se observa un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. Hay hemólisis parcial cuando se advierte la presencia de un botón sedimentario, que se acompaña de un sobrenadante rojizo y transparente. Y, es hemólisis total cuando sólo se aprecia la existencia de un líquido rojizo y transparente
• Si los eritrocitos presentes en el botón sedimentario de cualquier tubo se resuspenden mediante agitación, el sobrenadante se enturbiará
• Espectofotómetro: el procedimiento ya está explicado en anteriores prácticas, por tanto en la presente se recoge de forma separada el líquido contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia ajustando la longitud de onda (540nm) 
• Blanco: líquido presente en tubo nº1
• Resultados en forma de %, tubo nº18 corresponderá a un 100%, el más hipotónico, el más hemolizado
• Fórmula:

%de hemólisis=A/Am x 100

 

(A: absorbancia líquido en el tubo analizado, Am: absorbancia líquido en tubo nº18)

 

• Hemólisis parcial clara en tubo nº10 (50% de hemólisis)
• Hemólisis total a nivel del 12,13,14
• ROE baja: esferocitosis hereditaria, eliptocitosis u ovalocitosis congénita y estomatocitosis hereditaria, en estas enfermedades la superficie de los hematíes está disminuida con respecto a su volumen, éstos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmótica
• ROE sube: la aparición de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solución salina a una concentración menor que lo prvisto. En talasemia minor y anemia ferropénica, estas células tienen incrementada su superficie en relación con su volumen, toleran mejor la entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osmóstica

 

HOJA DE TRABAJO

 

A) ¿Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico?

7,4

 

B) ¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que éstos se rompan?

70%

 

C) ¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba?

Heparina

 

D) En esta prueba, ¿cuál es la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones?

0,5g/l

 

E) ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE?

Talasemia minor y anemia ferropénica

 

RESULTADOS OBTENIDOS

 

Tubo nº1 : 0,149

Tubo nº2: 0,958

Tubo nº3: 1,081

Tubo nº4: 1,206

Tubo nº15: 1,208



Tubo nº16: 1,197
Tubo nº17: 1,203
Tubo nº18: 1,99

Ejemplo tubo nº1: 0,149/1,99 x 100; 7,48%

(Nota: en la práctica hemos cogido los 4 primeros tubos y los 4 últimos. En el espectofotómetro hay que ponerlos del más diluido al más concentrado, se van poniendo el más claro es decir el 1, los hematíes no se habrán roto. Cuando se habla de concentración se habla de color)