domingo, 8 de marzo de 2015

PRÁCTICA XXXIII (27/02/15)

 
PRUEBA DE LA SACAROSA


INTRODUCCIÓN

Situar los hematíes problema en un medio de baja fuerza iónica (solución sacarosa), los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que los glóbulos rojos presentes en la muestra tienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento tienden a sufrir la acción de éste, y a lisarse
Muestra sangre venosa completa y anticoagulada con EDTA, por ejemplo
Hemos cogidos dos muestras diferentes, sangre control y sangre problema

MATERIAL
  • Pipetas pasteur
  • Pipetas graduadas ( 1 de 5ml, 2 de 2 ml, 3 de 0,5ml)
  • Pipeta automática (100 microlitros) para hacer 0,1 ml
  • 6 tubos de centrífuga
  • Reloj
  • Centrífuga
  • Espectrofotómetro
  • Cubetas de espectrofotómetro
  • Gradilla
REACTIVOS
  • Solución acuosa de sacarosa (azúcar) a una concentración del 9,24%
  • Sangre control (extraída recientemente)
  • Solución acuosa de amoniaco a una concentración del 0,04%
-0,2ml de hidróxido amónico (NH4OH) al 20%
-99,8ml de agua destilada
  • Suero fisiológico (solución salina al 0,9%)
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TÉCNICA O PROCEDIMIENTO
  • 3 Tubos: uno con las siglas SF (suero fisiológico), otro SC (sangre control) y SP (sangre problema)
  • Rellenar con:
Tubo SF: 1,8 ml de suero fisiológico + 0,2 ml de sangre problema
Tubo SC: 1,8 ml de solución sacarosa + 0,2 ml de sangre control
Tubo SP: 1,8 ml de solución sacarosa + 0,2 ml de sangre problema
  • Agitar los tubos
  • Dejarlos a temperatura ambiente durante 30minutos
  • Centrifugar a 2000 rpm/5min
OBSERVACIÓN
  • Su lectua puede ser visual o espectrofotométrica
  • NO HEMÓLISIS: se observa un botón sedimentario rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente
  • SÍ HEMÓLISIS: cuando se advierte la presencia de un líquido rojizo y transparente, en los tubos SF Y SC no tiene que haber hemólisis, ya que estos tubos funcionan como controles negativos
  • Lectura espectrofotométrica:
Tubo TB (tubo blanco): 5ml de solución de amoniaco + 0,3ml de suero fisiológico
Tubo TPr (tubo problema): 5ml de solución de amoniaco + 0,3 ml de sobrenadante del tubo SP
Tubo TPa (tubo patrón): 5ml de solución de amoniaco + 0,3 ml líquido resuspendido del tubo SF
  • Se utiliza el líquido del tubo blanco para poner el aparato a 0 de A, y el líquido del tubo patrón se emplea para determinar la A que corresponde a un 100% de hemólisis
  • Fórmula:
% de hemólisis= A/Am x 100

 
(A: absorbancia del líquido presente en el tubo problema, Am: absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón )
  • La prueba de la sacarosa suele ser positiva en la HPM, en esta enfermedad su grado de positividad es de 10-80% de hemólisis
  • Es negativa en la diseritropoyesis congénita tipo II (HEMPAS)
HOJA DE TRABAJO
 
A) ¿A qué concentración se prepara la solución de sacarosa?
9,24%
 
B) ¿Cómo se llama la sacarosa?
Azúcar común
 
C) ¿Cómo se prepara el tubo blanco?
5ml de solución de amoniaco + 0,3 ml de suero fisiológico
 
D) ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, en la sangre de la HPN?
10-80% de hemólisis
 
RESULTADOS OBTENIDOS
 
TB= 0,155
TPr= 0,115
TPa= 0,121
 
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