Tiempo de coagulación (2/03/15)

INTRODUCCIÓN

Es el tiempo que tarda en generarse un coágulo en una muestra de sangre no anticoagulada, que se pone en contacto con una superficie de vidrio
Muestra de sangre en fresco

MATERIAL

• Lancetas
• Gasas
• Capilar (azul)
• Baño maria a 37ºC

REACTIVOS

• Alcohol

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Desinfectar bien la punta del dedo
• Pinchar con lanceta
• LLenar 1/3 del capilar azul
• Se sitúa la muestra en el baño maría a 37ºC
• Moverlo dentro de éste hasta que coagule y mirar el tiempo transcurrido

OBSERVACIÓN

• El tiempo de coagulación depende de numerosas variables (el volumen de la muestra que analiza y la superficie del tubo que entra en contacto con la sangre) para su determinación reproductible, la técnica empleada ha de estar perfectamente estandarizada
• Valores normales: 5 a 10 minutos
• Este estudio permite la detección de trastornos relacionados con la vía intrínseca con la vía común de la coagulación
• Alarmiento en: déficits de factores de la vía intrínseca (hemofilia), situaciones de afibrinogenemia y fibrinolisis excesiva, terapias con heparina, esta prueba puede utilizarse en el control de los tratamientos heparínicos
• Esta prueba es poco sensible, ya que no detecta déficits ligeros de factores, por lo que está en desuso

(Nota: el día 2 falté, y no la he realizado en laboratorio, por lo que no tengo ni fotografías ni el tiempo realizado, me enteré el último día que esta práctica estaba realizada por lo que la pongo la útlima ya que todas las otras están subidas)

Curva fibrinógeno (práctica XL)

Curva actividad protrombina (práctica XXXIX)

Curva electroforesis (práctica XXXI)

PRACTICA XLI (10/03/15)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL

 

INTRODUCCIÓN

Se realizan cuando tiempos determinados en el plasma problema (TTPA) está alargado
Se mezclan a partes iguales el plasma problema y plasma que se sabe que es normal, y se incuba 37ºC durante 60 minutos
Si los tiempos determinados en la mezcla se corrigen, falta algún factor en el plasma problema y su carencia ha sido compensada con el aporte suplementario de factoes contenidos en el plasma o en suero normales
La prueba de mezcla se practica con plasma normal, cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado, aquí se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y de los factores VIII, IX, XI o XII
Se mezlca a partes iguales el PPP problema con PPP normal, y se repite la determinación del TTPA, pero no en el PPP problema puro, sino en la mezcla preparada, tras lo cual, se incuba la mezca a 37ºC durante 60 mintuos
Si el TTPA en la mezcla se corrige, falta en el plasma problema alguno de los factores de la vía intrínseca que sin embargo, sí está presente en el PPP normal
Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como actuación d esustancias inhibidoras de la coagulación
Muestra: plasma pobre en plaquetas (PPP)  y un TTPA anómalo, es decir, alargado
A partir del PPP anómalo hay que preparar una dilución 1/2 con el pool de plasmas normales o con el plasma contro normal

PPP ANÓMALO: 100 microlitros
Pool de plasmas normales o plasma control normal: 100 microlitros
Dilución: 1/2
Dilución incubar 37ºC durante 60 minutos

MATERIAL

• Gradilla
• 2 cubetas coagulómetro
• Coagulómetro
• Pipeta 100 microlitros
• 4 puntas de pipeta
• Baño de agua 37ºC
• 3 tubos de ensayo de plástico

REACTIVOS

• Solución de cloruro cálcico 0,025 M
• Cefalina activada con ácido elágico
• Pool de plasmas normales o un plasma control normal

Imagen realizada en el laboratorio


TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Homogeneizarlos
• Depositar el volumen necesitado en 3 tubos de ensayo de plástico
• Atemperar los reactivos a 37ºC durante 5 a 15 minutos
• 2 cubetas de coagulómetro e introducir sus trozitos de acero
• Roturarlas con M1 y M2
• Verter 100 microlitros de la dilución de la muestra en cada cubeta
• Añadir 100 microlitros de cefalina activada
• Mezclarla bien mediante la pipeta automática
• Incubarla 37ºC durante 2min (coagulómetro)
• Colocarlas e introducir 100 microlitros de CaCl2 0,0025 M
• Al agregarla comienza la lectura y cuando se forma el coágulo  nos ofrece el tiempo transcurrido en la pantalla

Imagen realizada en el laboratorio


OBSERVACIÓN

• Valores normales: 30 y 40 segundos
• Un tiempo superior se considera alargado
• Como el TTPA de la dilución de la muestra se determina dos veces, se calcula la cifra media de esta pareja d valores, este valor medio es el resultado final de la determinación
• TP normal y TTPA alargado: trastorno vía intrínseca
• En este caso se incuba la mezcla de plasma y cefalina activada durante 15 mintuos, si con este cambio se corrige el alargamiento del TTPA, se torna normal y hay un déficit de PK
• SI tras aumentar el tiempo de incubación, no se corrige, tiene que hacerse una prueba de mezcla con plasma normal
• Si tras la mezcla con plasma normal se corrige, deja de estar alargado, es porque falta algún factor de la vía intrínseca (VIII, IX,, XI XII) en la muestra y su carencia ha sido compensada con el aporte suplementario de factores contenidos en el plasma normal
• Si, tras la mezca con plasma normal, no se corrige el TTPA, se debe investigar la presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación (heparina, PDF, inhibidor tipo lupus,etc )

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?
Cuando aumenta el TTPA tras ser incubado y no se corrige

B) Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿qué se debe investiar?
Presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación


RESULTADOS OBTENIDOS

Hemos utilizado el plasma control de un compañero tras su extracción de sangre venosa
Resultados: tiempo 20,7 y ratio 0,74

PRACTICA XLI (9/03/15)

 

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE FIBRINÓGENO

 

INTRODUCCIÓN

El fibrinógeno en presencia de exceso de trombina se transforma en fibrina
El tiempo de formación del coágulo es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente en el plasma
La determinación de fibrinógeno por el tiempo de coagulación de trombina, está basada en el método descrito por Clauss
En presencia de altas concentraciones de trombina, el tiempo necesario para la fomación del coágulo en el plasma diluido es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno
Factor I (fibrinógeno) proteína sintetizada en el hígado, componente de la sangre utilizado para formar el coágulo
Su determinación nos ayuda a evaluar las alteraciones en los mecanismos de coagulación
Se incrementa en inflamaciones agudas y embarazo
Valores bajos en terapias trombolíticas, enfermedades hepáticas, disfrinogenia congénita, DIC y pancrealitis
La muestra es plasma obtenido por punción venosa diluido 1/10 en solución citrato trisódico 3,8%
Mezclar la sangre con el anticoagulante
Centrifugar la muestra a 3000 rpm/10min


MATERIAL

• Coagulómetro

Imagen realizada en Laboratorio

• Baño a 37ºC
• Equipamiento habitual de laboratorio

REACTIVOS

• R1 (reconstituir con 2ml de agua destilada), R2(agitar antes de su uso) y R3 (listo para su uso)

Imagenes realizadas en Laboratorio

TECNICA O PROCEDIMIENTO

• Preparar dilución 1/10: 50 microlitros muestra + 450 microlitros de R2 (tampón imidazol)

                  TUBO 1             T2             T3            T4            T5

Dilución
Calibrador     1/40               1/30          1/20         1/10        1/5

R2 (ml)           3,9                 2,9            1,9           0,9         0,4

COAGU
LATION         0,1                0,1             0,1          0,1         0,1
CAL
(ml)

• A 0,2 ml de cada dilución añadir 20 microlitros de R3
• Atemperar a 37ºC durante 4-6minutos
• Añadir 0,1 ml de R1 (pone fibrinógeno) y cronometrar la formación de coágulos
• No atemperar la trombina R1

 

 

 

 

Imagenes realizada en Laboratorio


OBSERVACIÓN

• Calcular la media de los duplicados de los tiempos de coagulación, despues de finalizar la reacción. Utilizar los cinco puntos del calibrados para crear una curva de los tiempos obtenidos en segundos, frente a los valores de concentración de fibrinógeno de cada dilución del caloibrador (mg/dl)
• Trazar la mejor curva, examinarla y omitir los puntos no lineales, la curva final debe constar de tres puntos consecutivos como míimo. La creación de la curva solo con los puntos mas lineales producirá la mejor recuperación en los controles y las muestras de paciente
• La siguiente curva de calibración es sólo orientativa, variando en función del lote y concentración del calibrador, así como del instrumento utilizado
• La dilución 1/10 del plasma representa el 100% del valor asignado
• Valores orientativos: 200-400 mg/dl (2-4 g/L)

RESULTADOS OBTENIDOS

DILUCION           CONCENTRACIÓN (mg/dl)             TIEMPO
    
      1/5                                478                                      11,7 (ratio 0,42)
      1/10                              239                                      15,6 (ratio 0,56)
      1/20                             119,5
      1/30                             78,87
      1/40                             59,75                                   46,9 (ratio 1,67)
   Muestra                           42,3                                             (ratio 1,51)

(Nota: las diluciones que no tienen indicadas su tiempo, es porque el día de la práctica realizada el coagulómetro daba valores muy altos; 200... y no lo anotamos)

Imagen de la curva correspondiente a fibrinógeno en papel (no se aprecia pero he realizado varias fotos y al subirlas se cambia y se aprecia así, está bien realizada en papel)

 

PRACTICA XL (6/03/15)

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

 

INTRODUCCIÓN

Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en % de actividad (Indice de Quick)
Para ello es necesario preparar una curva de actividad de protrombina e interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP en el plasma problema
Se prepara una batería de diluciones a partir de un plasma contro normal y se mide el TP del plasma control normal no diluido y de cada una de las diluciones, se asigna el 100% de actividad al número de segundos medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el % que les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones
Con todos estos datos se traza una curva de calibrado anotando en el eje vertical los valores en segundos del TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones y en el eje horizontal el % de actividad asignado a cada uno de ellos

MATERIAL

• 8 tubos de ensayo de plástico
• Prepipeta
• Pipeta graduada de vidrio de 1ml (1000 microlitros)
• Pipeta para 100 y 200 microlitros mas 7 puntas de pipeta (amarillas)
• 5 cubetas  coagulómetro
• 5 trocitos de acero
• Coagulómetro
• Baño de agua a 37ºC
• Hoja milimetrada, regla, boli
• Gradilla

REACTIVOS

• Solución salina al 0,85% ( Dietil-barbiturato de sodio 2,94g, acetato de sodio 1,94g, y agua destilada 100ml)
• Tromboplastina cálcica
• Pool de plasmas normales o plasma control normal

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

• Homogeneizar la tromboplastina cálcica y las diluciones del plasma sin agitarlas bruscamente
• Depositar el volumen total de tromboplastina cálcica en un tubo de ensayo de plástico

                          TUBO 1          T 2        T 3            T 4             T5

Pool de plasmas     200             200        200           200             200
o plasma contro
(microlitros)

Solución salina
al 0,85%
(microlitros)           0                200         400           600             1800

Dilución               1/1               1/2          1/3            1/4               1/10

% de actividad     100              50            33             25                  10

• Atemperar la tromboplastina cálcica a 37ºC entre 5 o 15minutos
• Introducir acero
• Rotular los tubos con sus correspondientes diluciones
• Verter 100 microlitro de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas en el % de actividad que les corresponde
• Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37ºC entre 3 y 5 minutos, pueden depositarse en la placa calefactora del coagulómetro
• Colocar cada una de las 5 cubetas en la celda de medida del coagulómetro y agregar 200 microlitros de tromboplastina cálcica, al agregarla se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza su lectura
• Cuando se forma el coágulo, el coagulometro sinaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica

OBSERVACIÓN

• Lo más correcto es determinar 3 veces el TP del plasma control puro y de cada una de sus diluciones y dar como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores

HOJA DE TRABAJO

A) ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?
Agua destilada

B) ¿Qué % de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?
50%

C) ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?
Cuando se agrega el RT

D) ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?
Los valores en segundos de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones

RESULTADOS OBTENIDOS

1/1 = 5,4
1/2 = 32,2
1/3 = 45
1/4 = 49,4
1/10 = 101,9